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春小麦高分子量谷蛋白12亚基基因克隆及积累调控研究

张薇  
【摘要】:小麦高分子量谷蛋白是小麦胚乳中主要贮存蛋白。高分子量谷蛋白的组成、数量和积累与小麦品质关系密切。研究以亚基类型均为2+12而加工品质差异明显的两个春小麦品种东农7742和新克旱9为材料,克隆高分子量谷蛋白(HMW-G)12亚基基因及其5′上游调控序列,研究两个品种籽粒灌浆期谷蛋白亚基积累和12亚基mRNA表达,从分子水平探讨转录水平调控对亚基积累的影响。 SDS-PAGE凝胶电泳表明,两个品种高分子量谷蛋白亚基均在籽粒形成过程中逐渐形成,并随籽粒灌浆进程亚基类型逐渐增多,亚基一旦形成,在以后胚乳发育过程中不再消失。东农7742高分子量谷蛋白亚基在开花后10天开始出现,14天亚基全部形成,新克旱9相应为12和18天,比东农7742亚基形成晚2—4天。籽粒形成初期高分子量谷蛋白亚基积累量少,随籽粒灌浆谷蛋白亚基积累渐增。两个品种均在开花后20天亚基积累速度加快,最快积累出现在开花后22-26天,但东农7742亚基积累速度和积累总量明显高于新克旱9。 利用RT-PCR方法研究小麦籽粒灌浆期高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA表达水平结果表明,东农7742的12亚基在开花后第六天出现mRNA的表达(积累),花后14天表达(积累)量最高。新克旱9mRNA的表达出现在开花后第10天,18天表达量达最高。在籽粒灌浆的各个时期,东农7742的12亚基基因mRNA表达量均明显高于新克旱9。12亚基基因mRNA的高表达可能是东农7742的12亚基蛋白积累量高的基础。转录及转录后水平的调控可能是亚基积累的主要调控方式。 利用PCR的方法克隆春小麦东农7742和新克旱9两个品种高分子量谷蛋白12亚基基因的全序列,分别命名pHG12DN和pHG12XKH(已在Genbank注册,注册号分别为AY486484和AY486485)。序列长度为1980bp,有四处碱基差异,导致一处氨基酸的变化。东农7742与文献报道的“中国春”序列同源性分别为99.5%,有10处碱基差异,存在两个氨基酸的缺失和一个氨基酸的替换。新克旱9与文献报道的序列同源性为99.6%,有7处碱基差异,但只有两个氨基酸缺失。目前尚不能确定氨基酸缺失和替换如何影响亚基的蛋白结构和特性,但东农7742、新克旱9和中国春(Chinese Spring)高分子量谷蛋白12亚基基因的克隆及详细的核苷酸和氨基酸序列分析,表明品种间存在差异,为通过原核表达和蛋白纯化对两种蛋白的特性进一步的研究提供可能和基础。 克隆的春小麦东农7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亚基基因全序列已在Genbank上注册(注册号分别为AY486484和AY486485) 设计简并引物通过PCR扩增,克隆长为917bp和919bp的东农7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亚基基因的上游调控序列。该序列存在一个TATA-box序列、三个CAAT-like box序列,两个GCN4 motif和一个E-box及两个E-like box,推测GCN4 motif和E-box与小麦胚乳的特异性表达有关。另外,在476—499bp处存在一个24bp的cereal box,该序列与禾谷类作物的—300元件同源性很高,在677—714bp处有一个38bp的HMW enhancer,该序列为高分子量谷蛋白启动子中一段高度保守区域。上述两个区域可能与高分子量谷蛋白基因表达量有关。克隆的两个12亚基基因上游调控序列为进一步通过缺


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