重组猪瘟病毒T细胞表位的猪细小病毒样颗粒亚单位疫苗研究

【摘要】：猪细小病毒(Procine parvovirus,PPV),属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属的成员,是引起母猪繁殖障碍(reproductive failure)的主要病原体之一。各种不同类型的猪均可感染,引起母猪发生流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。 猪瘟(Classical Swine Fever,CSF 或Hog Cholera,HC)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病,是危害养猪业的主要传染病之一。猪瘟除了可以引起败血症之外,还可引起一系列其它临床表现,如妊娠母猪流产、胎儿畸形、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统受损、继发或并发细菌或其他病毒感染等。而且各种年龄的猪均易感,给养猪业带来巨大的经济损失。因此,研制和开发具有良好的免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗来接种健康猪群和感染者具有重要的现实意义。 本研究以CSFV 的优势T 细胞表位E290(含CSFV 特异的辅助性和细胞毒性T 细胞表位)为基础,以PPV 的核衣壳蛋白VP2 基因为支架载体分子,来研制预防猪瘟和猪细小病毒病的病毒样颗粒疫苗的新思路,在国内外尚未见有类似报道。 首先,对分离的PPV 毒株LJL12,在PK15 细胞上进行增殖,根据Genbank 报告的参考毒株VP2 基因的核苷酸序列,利用Oligo 和Primer5.0 等软件,设计合成一对引物,以LJL12 的DNA 为模板,应用PCR 扩增出长约1.7Kb 的VP2 基因片段,将该基因片段克隆到pMD–18T 载体,并进行了酶切、PCR 鉴定和序列测定,并将测序结果与Genbank 报告的其他毒株VP2 基因进行序列比较,发现与其他毒株的核苷酸同源性均在99%以上,推导的氨基酸同源性均在98%以上,说明LJL12 株VP2 基因的保守性很高。 将从pMD-18T-VP2 中酶切纯化后的VP2 基因克隆至真核表达载体pMel BacA 的XhoⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上,命名为PM-VP2。酶切和PCR 鉴定结果表明,获得了PPV VP2 基因与pMel BacA 质粒的阳性重组子。 根据Brown 等报道的CSFV T 细胞表位E290 的基因序列,设计一对引物,使上下游引物之间重叠18 个碱基,并对酶促合成方式进行改良,采用普通的Taq 酶,扩增获得了大小约为60bp 多肽基因片段E290。将用酶促合成方法获得的E290 的基因,克隆至重组质粒PM-VP2 的VP2 基因5’端上游,并命名为PM-VP2-E290。对重组子PM-VP2-E290 进行酶切和序列测定,测定结果表明,扩增产物的序列与原设计的序列的同源性为100%。 纯化重组子PM-VP2-E290 阳性质粒,并与Bac-N-Blue DNA 共转染昆虫细胞sf9,96h后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA 分子的PCR 鉴定表明,获得了杆状病毒DNA 与E290-VP2 基因的重组子,命名为P-1 代病毒。将经过三次噬斑筛选纯化后的P-1 病毒接种于sf9 细胞上进行增殖,PCR 鉴定后完全纯化的病毒,命名为P-2 代病毒。并按同样方法制备高效价的P-3 代病毒,以备用于表达。 将高效价的P-3代重组杆状病毒接种于形成50%单层的sf9细胞,4天后收获病变细胞,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western-blot)和免疫酶斑点技