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热应激对小鼠附植前早期胚胎发育影响的研究

杜立银  
【摘要】:选择昆明白鼠为受试动物, 以注射人绒毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin,hCG)后的胚胎发育阶段为标准(注射hCG 完毕为0h),分别在早期合子(注射hCG 后16~20h)、晚期合子(第一次分裂初期,注射hCG 后28~32h)、2 细胞中期(注射hCG 后40~44h)对母体和体外发育胚胎实施了温和热应激(37℃4h)、中度热应激(39℃4h)、重度热应激(41℃4h)和极度热应激(43℃4h)。运用胚胎形态学观察法,研究比较了热应激对体内和体外发育的附植前早期1~2 细胞小鼠胚胎的负效应;运用免疫荧光细胞化学的方法,研究比较了热应激对体内和体外发育胚胎内热休克蛋白70(HSP70)的诱导表达,确定胚胎热耐受的发育获得与胚胎阶段的关系,从而在细胞水平和分子水平上进一步验证和揭示了胚胎热耐受机理。最后,运用免疫荧光组织化学的方法,检验了卵巢组织在热应激后0~28h 恢复期内的HSP70 诱导表达,以拓展对HSP70 表达的组织特异性的认识(热应激温度同胚胎)。试验结果如下: 1.母体热应激对体内1~2 细胞胚胎的后继发育能力具有显著的影响: 母体热应激后,早期合子、晚期合子和2 细胞中期胚胎发育到4 细胞的百分率降低,胚胎阶段越早、温度越高差异越显著,并且温度水平上的负效应大于胚胎细胞阶段的负效应。在温度水平上:与37℃组相比,39℃组差异不显著(p0.05)、41℃和43℃差异极显著(p0.01,p0.01);与39℃相比,41℃(p0.05)和43℃(p0.01)均有显著差异,但两组之间无差异(p0.05)。在胚胎发育阶段上:早期与晚期合子的热应激差异不显著(p0.05),但早期合子与2 细胞中期的差异显著(p0.05)。这说明胚胎在发育过程中抗热应激能力逐渐增强。 晚期合子阶段的37℃温和母体热应激,非但没有诱导胚胎的热耐受,反而加剧了再次高温对2 细胞中期胚胎发育的阻抑程度(p0.05)。这说明,合子尚不具备获得热耐受的能力。 正常体外发育条件下,来自39℃热应激鼠的4 细胞胚胎,在37℃正常培养条件下,注射hCG 后16~20h、28~32h、40~44h 组和对照组的发育率(57.9%,58.8%,67.6%,59.1%)相比,试验组依次升高,前两组均低于对照组,而40~44h 组高于对照组,且与16~20h 组差异显著(p0.05),其他组间无显著差异。在体外43℃4h 热应激条件下,注射hCG 后16~20h、28~32h、40~44h 组的百分率渐次升高(0.8%,2.8%,7.0%),而且三者间差异显著(p0.05,p0.01,p0.05);同时,试验组中的16~20h 组和28~32h 组均显著低于对照组(p0.01,p0.05),而40~44h 组则高于对照组(5.0%)。可见,早期合子和晚期合子阶段的39℃母体热应激降低了4 细胞胚发育到囊胚的能力,而对应的2 细胞中期胚胎却略有提高。这说明,母体热应激的负效应可在胚胎体外发育过程继续发挥作用,并与母体热应激的胚胎阶段密切相关。 2.热应激对体外发育的1~2 细胞胚发育具有显著的负效应:在合子早期、晚期合子和2细胞中期热应激处理体外发育胚胎后,从发育至囊胚的百分率看(10.5%,13.1%,20.0%),胚胎抗应激能力显著提高,温度升高则显著降低(33.6%,17.6%,5.6%,1.7%)。这说明,胚胎在发育过程中对热应激的抵抗力显著提高(p0.05 或p0.01)。 3.热应激对体外和体内1~2 细胞胚胎发育具有负效应差异:体外发育的胚胎分别在合


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