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猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

周艳君  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS)是一种以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为主要特征的传染病。由于PRRSV以侵害免疫系统为主,且易发生变异,可造成持续感染,而且具有抗体依赖增强作用,致使对该病的诊断和预防带来了很大困难。而通过单克隆抗体技术对PRRSV抗原表位进行深入研究,不仅有助于了解PRRSV抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。 本研究首先构建了含PRRSV CH-1a株各结构蛋白的重组表达载体pET30a-N、pGEX6p-rtM、pGEX6p-rtGP5、pET30a-GP4、pGEX6p-rtGP3和pGEX6p-rtGP2,并在大肠杆菌中进行了表达,利用PRRSV感染猪血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的六个融合蛋白都具有较好的反应活性。然后以PRRSV和表达的融合蛋白为抗原,免疫BAL B/c小鼠,最终共获得了16株针对N蛋白的单抗,15株针对GP5蛋白的单抗,5株针对GP3蛋白的单抗以及针对M蛋白、GP4蛋白和GP2蛋白的单抗各1株。 将N蛋白基因分为四个相互重叠的基因片段,对16株抗N蛋白的单抗进行鉴定,结果显示有7株单抗既能特异性识别ORF7-N2又能识别ORF7-N3的表达产物,其余9株单抗仅与全长的N蛋白发生反应,而不识别四个分段融合表达蛋白,推测9株单抗的抗原表位为构象依赖性抗原表位。将片段N2和N3相互重叠的部分(49-70aa)分成一系列小的基因片段,对7株单抗鉴定结果显示,有6株单抗能特异性识别融合多肽NEP3(49-58aa),而另外一株单抗N1H11对以上7个融合多肽均不识别,仅对49-70aa编码的肽段表现出了较弱的反应性,推测49-70aa仅是单抗N1H11抗原表位的一个组成部分。通过对NEP3从N端和C端进行一系列截短分析,确定了6株单抗抗原表位的主要功能区域,其中单抗N2H7识别的主要功能区域为H~(54)FPLA~(58)。单抗N2F7识别的主要功能区域为K~(52)PHFPLA~(58)。单抗N1A2、N1E3、N1G4、N2E5识别的主要功能区域为E~(51)KPHFP~(56)。对欧美分离株氨基酸的序列比较结果显示这三个相互重叠的抗原表位在所有欧美分离株中都是高度保守的。而且利用PRRSV感染猪血清进行Western blot分析,结果表明抗原表位NEP3在PRRSV感染时具有较好的免疫优势。与LV株中由51-67aa和80-90aa共同组成的构象抗原表位不同,我们鉴定的抗原表位51-56aa、52-58aa和54-58aa虽然包含在这个构象表位之中,却是一个独立的线性免疫优势抗原表位,且位于核定位信号序列内部。 利用M基因两个相互重叠的片段M1(84-134aa)和M2(113-174aa)的融合表达产物对单抗M2B3进行检测,结果表明单抗M2B3既能识别M1又能识别M2基因片段的表达产物,推测其抗原决定区域位于二者相互重叠的部分112-134aa。选取二者重叠区域112-134aa并分别从N端和C端进行一系列截短,利用融合多肽ELISA对单抗M2B3进行鉴定,结果显示单抗M2B3不仅能特异性识别MEP1(112-134aa)而且还识别MEP2(117-134aa)和MEP3(112-129aa),但对其他融合多肽都不识别,据此确定117-129aa是单抗M2B3的主要抗原性区域。PRRSV感染猪血清中对MEP1~MEP3融合多肽进行Western blot分析结果显示,三个融合多肽都能被感染猪血清特异性识别,因此确定表位117-129aa是PRRSV的优势抗原表位,


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