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中生菌素生物合成基因zpsA的克隆及功能鉴定

李丽华  
【摘要】:中生菌素(Zhongshengmycin)是由淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var. hainanensis)合成的N-糖苷类农用抗生素,对农作物细菌性病害和真菌性病害具有良好的防治效果。 本研究在同类抗生素(诺尔丝菌素、链丝菌素)生物合成相关基因序列已知的基础上,利用PCR 的方法对淡紫灰链霉菌海南变种的中生菌素生物合成酶(β-赖氨酸活化酶)基因进行克隆和序列分析,并最终对其功能进行鉴定。 根据非核糖体肽合成酶A 域(腺苷酸化域)氨基酸序列中存在的十个保守区,并根据已知的诺尔丝菌素肽合成酶基因(npsA)序列和链丝菌素肽合成酶基因(sttA)序列设计出多条PCR 引物,以UV-69 菌株的总DNA 为模板,先后扩增出四段长度分别为284bp、611bp、370bp 和350bp 的基因序列,经过拼接最终得到1.025kb 的中生菌素肽合成酶的基因(zpsA)序列。在GeneBank中进行比对,结果表明,克隆出的基因与诺尔丝菌素肽合成酶、链丝菌素肽合成酶以及非核糖体肽合成酶的基因序列有着很高的同源性,相应基因编码的蛋白也具有很高的同源性,基因和蛋白的同源性都达到了75%以上。根据比对结果,推测zpsA 基因编码的是β-赖氨酸活化酶,与npsA和sttA 编码的蛋白功能相同。具有非核糖体肽合成酶腺苷酸化域的功能(A 域)。 应用基因单交换插入失活的原理,进一步鉴定了zpsA 基因的功能。构建用于基因破坏的温度敏感型重组质粒pK2(pKC1139::611bp zpsA),对中生菌素产生菌淡紫灰链霉菌海南变种UV-69 菌株原生质体进行转化,39℃培养10 天,利用安普霉素抗性筛选,得到了重组的阻断株。通过PCR的方法初步确定zpsA 基因被破坏。将阻断株进行摇瓶发酵,测量效价。结果表明,阻断株产素效价明显低于出发菌株UV-69,说明zpsA 基因参与了中生菌素的生物合成,编码中生菌素生物合成过程中的一个重要酶。 在进行zpsA 基因功能鉴定实验之前,对UV-69 的原生质体的再生及转化系统进行了优化。筛选到的最佳条件为:再生平板为HCM 培养基,菌体发酵液中的甘氨酸浓度为0.5%,溶菌酶的浓度为3mg/ml,溶菌温度和时间为35℃1.5 小时。转化时,PEG1000 的使用浓度为25%。


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