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旋毛虫49ku ES抗原基因核酸疫苗构建及免疫保护作用研究

路义鑫  
【摘要】: 本研究根据GenBank中已发表的序列(M64242)为参考设计引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K的方法提取总RNA,用RT-PCR方法从黑龙江猪、犬、猫旋毛虫,美国猪旋毛虫、旋毛形线虫、本地毛形线虫6个旋毛虫隔离种的成囊前期幼虫及黑龙江猪旋毛虫不同发育时期(成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫)虫体中扩增出了带有Kozak序列的49ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1。构建了重组质粒pMD18-T-S/EL、pMD18-T-D/EL、pMD18-T-C/EL、pMD18-T-AS/EL、pMD18-T-T1/EL、pMD18-T-T2/EL,pMD18-T-S/ML和pMD18-T-S/AM,经PCR、限制性内切酶EcoRI和BamHI进行单、双酶切鉴定,阳性质粒测序。成功克隆了6个旋毛虫隔离种成囊前期幼虫及猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49ku ES抗原基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为951bp,包含完整的阅读框,编码316个氨基酸残基。 所获6个旋毛虫隔离种基因序列经同源性分析表明,6个旋毛虫隔离种与GenBank上发表的序列核苷酸的同源性为97.0%~97.5%,推导氨基酸的同源性为93.4%~94.6%。6个隔离种之间的同源性为99.3%~99.9%,基因的保守性很强,不同隔离种之间的差异很小,其编码蛋白的抗原性也基本相同。 所获猪旋毛虫不同发育时期虫体基因序列经同源性分析表明,猪旋毛虫成囊前期期幼虫、肌幼虫和成虫与GenBank中已知序列的同源性分别为,97.5%、97.3%和97.3%;猪旋毛虫不同发育时期虫体之间具有高度同源性,成囊前期幼虫与肌幼虫的核苷酸序列同源性达99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在第665位点上有一个T→C突变;与成虫的同源性同样为99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在848位点上有一个A→G突变;肌幼虫与成虫相比,同源性为99.8%,在第665位C→T、在848位A→G。导致与之相对应的氨基酸序列发生相应的改变。其编码蛋白的抗原性也很稳定,同种不同发育时期虫体之间的差异很小。 将真核表达载体pcDNA3.1(+)与pMD18-T-S/EL分别用BamHⅠ和EcoR I双酶切,胶回收纯化后连接。经PCR、酶切鉴定,证明P49-S/EL基因按设计要求已插入表达载体中,构建了真核表达载体pcDNA-P49-S/EL。 将家兔随机分为A、B、C组,分别肌肉注射pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-P49-S/EL和pcDNA3.1-P49-S/EL+LipofectamineTM2000。每只家兔100μg/100μl,共免3次,每次间隔1周。首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、51d采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化,同时检测外周血CD4+、CD8+T细胞动态变化。 A组家兔血清在旋毛虫攻击感染后21d(42d)开始检出阳性抗体,然后迅速升高;B组家兔血清在免疫期间一直没能检出阳性抗体,而是在旋毛虫攻击感染后14d(35d)开始检出阳性抗体,而后迅速升高;C组家兔血清在3免后7d(21d)即可检出阳性抗体,旋毛虫攻击感染后,血清抗体OD值有所下降,而后呈逐渐上升趋势,第51d OD450达到2.128,与A、B两组相比差异极显著(P0.01)。 首次免疫后B组与C组家兔外周血CD4+T细胞减少;2次免疫后B组、C组仍然降低,


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