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表达H3N2亚型猪流感病毒HA的重组伪狂犬病病毒免疫效力的评价

郑宝亮  
【摘要】: 猪流感(SI)是一种非常普遍的猪的急性、热性和高度接触性呼吸道系统疾病,其病原主要是H3N2或H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。由于猪可感染禽流感病毒和人流感病毒,被认为是流感病毒的混合器和新亚型流感病毒的加工场,因此,研制安全、有效的SIV疫苗来预防猪流感不但可以减少养猪业的经济损失,而且对食品安全和公共卫生具有重要意义。 本研究将含有H3N2亚型猪流感病毒A/Swine/Inner Mogolian/547/2001(H3N2)(简称SwIM547)血凝素(HA)基因的转移载体pLTK-HA与伪狂犬病疫苗毒株Bartha-K61的基因组共转染Vero细胞,通过数代蓝斑克隆筛选、纯化后,获得了一株重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-HA。Western-blot实验表明,此重组病毒所表达的HA蛋白的分子量为60ku左右。间接免疫荧光试验显示,HA蛋白表达于被感染细胞的胞浆中。 为了评价此重组病毒作为侯选疫苗的免疫效力,本研究先后以鼠和猪为动物模型对其进行了评价。以小鼠为动物模型对重组伪狂犬病病毒rPRV-HA进行的免疫效力评价试验中,按每只10~(5.0)TCID_(50) rPRV-HA的剂量通过滴鼻接种8周龄雌性BALB/c小鼠(n=60),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=60)、非免疫攻毒对照组(n=20)和非免疫不攻毒对照组(n=10)。于免疫后不同时间分别从rPRV-HA免疫组和Bartha-K61免疫对照组随机剖杀一定数量的小鼠,其余小鼠于免疫后第28d用10~(5.0) TCID_(50)同亚型SIV毒株A/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2) (SwHLJ74)进行攻击。攻毒后第4、7和14d,分别剖杀小鼠,进行间接免疫荧光、病毒分离、血清学和病理组织学检测。结果表明,重组病毒主要分布于肺脏;免疫后14d起,从rPRV-HA免疫组及Bartha-K61免疫对照组均可检测到针对PRV的荧光抗体;从rPRV-HA免疫组可以检测到针对SIV的荧光抗体和血凝抑制抗体,而各对照组均呈阴性。攻毒后从rPRV-HA免疫组小鼠未分离到攻击病毒,血凝抑制抗体显著升高,病理变化比对照组明显轻微,表明rPRV-HA免疫小鼠可以抵抗同亚型SIV的攻击,可以作为rPRV-HA免疫效力评价模型。 以商品猪为动物模型,对重组伪狂犬病病毒rPRV-HA进行的免疫效力评价试验中,按每只10_(5.0) TCID_(50) rPRV-HA的剂量通过肌肉注射接种4周龄断奶仔猪(n=12),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=5)和非免疫攻毒对照组(n=5)。免疫后35d用2×10~(5.0) TCID_(50)同亚型SIV毒株A/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2) (SwHLJ74)进行攻击。免疫组和对照组攻毒后均无临床症状,但对照组有明显的体温升高,显示出了免疫组受到一定的保护作用。小猪鼻拭子分毒结果显示免疫组和对照组在攻毒后6d都能分离到病毒。从支气管和肺泡冲洗液的检测结果可以看出,攻毒后4d各组均可检测到病毒,7d时rPRV-HA免疫组却没有再次检测到病毒,对照组则仍可以检到病毒。rPRV-HA免疫组及Bartha-K61对照组免疫后7d均可检测到针对PRV的中和抗体;rPRV-HA免疫组可以检测到针对SIV的血凝抑制抗体,而各对照组均呈阴性,并且所有对照组小猪也在攻毒之后7d开始产生了血凝抑制(HI)抗体。尸体剖检结果方面,组织冰冻切片的间接免疫荧光未检测到任何病毒粒子,免疫组与对照组均只有个别小猪肺脏出现轻微病理变化,其统计学意义不大,但是显微病理变化方面rPRV-HA免疫组却表现出非常明显的病理保护作用。综合本试验结果,rPRV-HA的免疫接种对同亚型SIV攻击具有较好的保护作用。


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