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多重耐药大肠杆菌与整合子—基因盒系统的研究

丁良君  
【摘要】: 大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一,给人类的健康和畜牧业的发展造成了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用,但随着抗菌药物的广泛应用,导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现,大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。整合子-基因盒系统(integron gene cassette system)介导的细菌耐药机制因能解释耐药基因的快速传播而倍受研究者们的广泛注意,并取得了很大的进展。整合子是一个能捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单位,为运动性的DNA分子,主要见于革兰氏阴性杆菌,以肠杆菌、铜绿假单胞菌为多见,革兰氏阳性菌最近也有报道,整合子是革兰氏阴性杆菌多重耐药性迅速发展的主要原因。整合子定位于染色体及具有广泛宿主的质粒或转座子上,包含两个保守的DNA片段,两片段的中央区是长度和序列可变的片段,可插入编码某种功能的基因,如耐药基因,被称为插入盒(Inserted cassette),亦称基因盒(cassette)。细菌通过整合子系统的整合酶,捕获外来的耐药基因,并在位于整合子上游启动子的作用下得到表达,使细菌具有耐药及多重耐药性,造成细菌多重耐药性的传播。因此,调查研究大肠杆菌多重耐药性,扩增整合子基因,检测整合子及其类型对从基因水平上探讨细菌耐药性的分子机制,具有重要的理论和实践意义。本实验旨在了解整合子-基因盒系统在多重耐药大肠杆菌中的分布、整合子的结构、传播及其介导的多重耐药机制,探索建立一种临床大量菌株监测是否含有整合子及其类型的新方法。 本试验首次对哈市地区养殖场不同来源大肠杆菌耐药性进行了调查,并对整合子-基因盒系统进行分析,确定了养殖场抗菌药物选择压力下,多重耐药大肠杆菌的发生发展动态,对跟踪多重耐药大肠杆菌的扩散并评估其危险性具有重要的意义。首次利用整合酶简并引物PCR扩增产物Int及Ⅰ型整合酶IntⅠ、Ⅱ型整合酶IntⅡPCR产物制备核酸探针,通过比较确定利用菌落原位杂交检测整合酶来确定细菌中是否含有整合子的方法更便捷,该方法在国内尚未见报道。并首次对含有整合子的多重耐药大肠杆菌进行了ERIC-PCR分子生物学基因分型,在株水平上揭示了其流行病学情况。具体试验内容与结果如下: 1.从哈尔滨市的猪场和鸡场内共分离鉴定出(人源、猪源、鸡源)301株大肠杆菌。采用WHO推荐的K-B法,测定分离菌株对常用的16种抗菌药的耐药性,药敏实验结果显示链霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑和复方新诺明的耐药率较高,猪源和鸡源大肠杆菌未发现对磺胺类药物敏感的菌株。同时耐3种以上抗菌药物的多重耐药菌株有247株,占总分离菌株数的82%。氨基糖苷类药物中,对链霉素耐药的菌株,对庆大霉素、新霉素、卡那霉素的耐药率都很高,其中,人源大肠杆菌交差耐药率为100%、猪源在80%以上、鸡源在74%以上。三种来源大肠杆菌对磺胺类药物磺胺甲恶唑及复方新诺明的交叉耐药率在97%左右。 2.采用PCR方法对多重耐药大肠杆菌进行整合子的检测,得到1009bp、1319bp、1664bp、1991bp、2449bp共2种类型,5种不同大小的整合子。其中,2449bD的整合子为Ⅱ型整合子,其余都为Ⅰ型整合子。1009bp整合子为猪源耐药菌特有,1319bp、2449bp整合子为鸡源耐药菌特有,1991bp大小的整合子为猪源菌和鸡源耐药菌共有,1664bp大小的整合子为猪源耐药菌、鸡源耐药菌和人源耐药菌共有。HinfⅠ内切酶酶切图谱分析表明,扩增的各类相近大小的整合子基因盒插入区片段,只有猪源耐药菌单带1009bp大小与猪源耐药菌双带中1009bp大小片段所含基因盒不同,其余相近大小的整合子基因盒插入区所含基因盒都相同。 3.整合子DNA经测序BLAST分析可知,1009bp整合子可变区含有aadA23b基因盒,或含有aadA2基因盒;1319bp整合子可变区含有arr-3、dfr16基因盒;1664bp的整合子可变区含有dfr17、aadA5基因盒;1991hp整合子可变区含有dhfrⅫ、aadA2基因盒及orfF开放阅读框;2449bp整合子可变区含有dfrA1、sat1、aadA1基因盒及orfX开放阅读框;所有整合子所含基因盒的结构共有6种,包括10种各不相同的基因盒和2种功能不明的开放阅读框。 4.利用地高辛标记制备了Int、IntⅠ、IntⅡ三种核酸探针,他们的显色敏感度为2pg,三种探针不与金黄色葡萄球菌ATCC_(25923) DNA、铜绿假单孢菌ATCC_(27853) DNA、及正常鼠肺组织DNA显色,探针特异性较好。Southern杂交显示三种探针检测整合酶基因与PCR方法的符合率为100%。地高辛标记的Int、IntⅠ、IntⅡ核酸探针,能有效地检测多重耐药大肠杆菌中整合酶的类型。与斑点杂交相比,菌落原位杂交检测整合酶来确定细菌中是否含有整合子,更适合养殖场大量菌株整合子类型的确定。 5.171株扩增出整合子的多重耐药大肠杆菌,经ERIC-PCR分子生物学基因分型显示可分为7个型别,每个型别ERIC-PCR条带的类型相同。 总之,本研究采用PCR方法调查了哈市周边地区养殖场整合子所含基因盒的种类,对含有整合子的多重耐药大肠杆菌进行了流行病学分型,制备了核酸探针,为临床大肠杆菌中整合子的监测建立了一种方便、准确的菌落原位杂交方法,也为进一步从基因水平探讨大肠杆菌多重耐药性的产生奠定了基础,整合子不仅与大肠杆菌多重耐药性有关,而且在耐药基因的传递和扩散中也起着重要的作用,本研究为进一步研究细菌耐药机制提出了新的方向。


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