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葡萄(Vitis vinifera)类病毒检测

彭山  
【摘要】: 类病毒是一类单链闭合环状RNA分子,具有自我复制能力,但不编码蛋白,大小为239-475nt,是迄今为止发现的最小病原物。葡萄是我国一种重要的经济作物,现已经证明它可以被5种类病毒侵染:葡萄黄痘类病毒-1(Grapevine yellow speckle viroid-1,简称GYSVd-1),葡萄黄痘类病毒-2(Grapevine yellow speckle viroid-2,简称GYSVd-2),澳大利亚葡萄类病毒(Australia grapevine viroid,简称AGVd),啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,简称HSVd) ,柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,简称CEVd)。对葡萄而言只有被GYSVd-1和GYSVd-2侵染时有明显症状,其它三种类病毒在葡萄中均表现为潜伏侵染,其中HSVd和CEVd侵染其他经济作物则会引起病害,严重影响果实的外观及商品价值。它可以通过修剪、嫁接等农事操作进行广泛传播。一旦感染类病毒后,最有效的控制方法就是将被感染的植株连根拔除,但这样将会严重影响其经济效益,因此,对于葡萄进行类病毒检测具有重要意义。本文旨在以葡萄为材料进行分子检测实验,为建立并完善葡萄类病毒的检测体系提供参考;通过对AGVd这种很罕见的类病毒进行序列分析比较,了解类病毒在不同地域、寄主间的变异情况,为今后研究类病毒致病机理以及与寄主的共进化关系奠定基础。 本实验制备了三种葡萄类病毒(GYSVd,HSVd,AGVd)的RNA探针及DNA探针,通过斑点杂交证明RNA探针比DNA探针灵敏1000倍左右。对采自北京、新疆的65个葡萄样品进行类病毒的检测,从以上样品中提取低分子RNA后,通过斑点杂交等方法检测。结果表明:38个样品中检测到GYSVd,其中北京35个样品,新疆3个样品,发病率达58.46%;4个样品中检测到AGVd,其中北京2个样品,新疆2个样品,发病率达6.15%;50个样品中检测到HSVd,其中北京43个,新疆7个,发病率达76.90%。 参照GenBank上发表的GYSVd、AGVd、HSVd、CEVd序列设计引物,筛选用于检测AGVd、HSVd的特异性引物;设计可以区分GYSVd-1和GYSVd-2的特异性引物;同时设计两对用于检测CEVd的特异性引物但均未得到阳性信号。 对斑点杂交阳性样品井川-1014和早玉进行AGVd的克隆、测序分析,并与GenBank中已发表的AGVd序列进行比较,结果表明:从北京葡萄样品上分离到的AGVd的序列与之前从中国新疆吐鲁番葡萄样品无核白上分离到的AGVd的同源性最高。唯一区别在于本实验得到的所有克隆的第15位碱基都有替换的现象。 本实验建立了Northern杂交用于检测类病毒的实验程序。用于检测GYSVd和HSVd时,0.75g样品足以达到检测目的;用于检测AGVd时,3g样品会有信号产生。 生物学检测的结果表明HSVd和AGVd同时侵染指示植物黄瓜(Cucumis sativus L. cv. Suyo)时,只检测到HSVd,可能是AGVd在指示植物内会受到HSVd的抑制。


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