鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表达及部分功能的研究

【摘要】： 鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis,DVE),又名鸭瘟(duck plague virus),是由鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾在多个国家和地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员,第八次国际病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒属。糖蛋白C(gC)是疱疹病毒的第二种主要囊膜蛋白,它对病毒的吸附、释放和毒力起着重要作用,而且能诱导中和抗体产生。因此,对gC蛋白的研究不仅对病毒分子生物学功能特征有重要意义,而且在临床诊断、疾病预防、基因工程疫苗研究也具有重要意义。 本研究以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组为模板,通过Tail-PCR的方法扩增了DEV C-KCE毒株未知的糖蛋白C(gC)基因及其两侧的序列,包括部分UL43同源序列、完整的UL44同源序列(gC基因)以及与UL45基因之间的部分非编码区,将其克隆到pMD18-T载体上,构建了pMD18-T-UL45-44和pMD18-T-UL44-43质粒,并进行了测序。DNA序列分析发现gC基因全长1296bp,编码431个氨基酸,有两个可能的启动子和poly(A)信号;部分UL43同源基因长600bp,编码200个氨基酸。对gC基因进行信号肽、糖基化位点(N-X-T/S)和跨膜区预测发现,gC基因的1-22位氨基酸为其信号肽区域;1-398位氨基酸位胞外区,399-421位氨基酸为跨膜区,422-431位氨基酸为胞质区;有四个潜在的糖基化位点。与12株已报道的具有完整gC (UL44)同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较,DEV C-KCE gC基因与α疱疹病毒gC同源基因有3个保守区域。系统进化分析DEV的gC基因,发现其与α-疱疹病毒亚科中禽的疱疹病毒亲缘关系较近。 利用大肠杆菌表达系统pET30a(+)(E. coli Rosetta),对不含信号肽部分的gC基因胞外区进行了原核表达,SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小为49kDa且具有较高的表达水平,目的蛋白(His-gC)占菌体蛋白的比例为30%。His-gC融合蛋白是以包涵体的形式存在的。 Western-blotting分析表明所表达的蛋白具有良好的抗原性。经分离纯化融合蛋白His-gC,制备了抗DEV gC蛋白的兔抗血清,并进行了特异性鉴定,特异性良好。 以生长在盖玻片上的CEF细胞中DEV病毒为抗原,以上述制备的兔抗DEV gC血清为一抗,进行间接免疫荧光染色,发现荧光主要集中于细胞膜和细胞质中。 以兔抗DEV gC血清为中和抗体,进行蚀斑减数中和试验。结果显示,所制得的血清有中和活性,从而间接证明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位。 以表达的重组gC蛋白为刺激原,进行鸭淋巴细胞增殖试验,试验结果表明:gC蛋白具有刺激机体T细胞的增殖功能。采集刺激鸭的淋巴细胞上清,用USCN公司的鸭IFN-γ检测试剂盒检测其中的IFN-γ水平。结果表明,gC蛋白能刺激淋巴细胞产生IFN-γ,说明糖蛋白C能刺激机体的细胞免疫。