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重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用

汪亮  
【摘要】: 随着转基因技术的发展和应用,尽管这项技术有着巨大的潜在效益,但人们也逐渐认识到其可能带来的负面效应。克隆动物及器官移植作为人类延续生命的重要技术而受到广泛关注,同时又与转基因动物安全性密切相关。因猪及其肾脏在生理学上与人体器官存在的类似性,所以能够作为一种重要的动物模型,成为目前研究最多的供体动物和供体器官。在获得克隆产物后,外源基因尤其是选择标记基因的去留问题成为了人们关注的交点。为了最大限度地降低选择标记基因带来的潜在风险,就需要对外源基因进行选择性的删除。本实验利用位点专一性重组系统,尝试构建含有重组酶识别位点的质粒,并以猪肾上皮细胞为研究材料,进行删除实验并验证其删除效果。 主要研究结果包括: (1)根据试验需要,设计中间为多克隆位点、两侧为双重组酶识别为点(CreFLP)的序列,并首次利用重叠延伸PCR技术得到全长211bp的目的片段,克隆目的片段到pMD18-T Simple骨架载体上: (2)分别以pcDNA3.1、pEGFP-N3、pIRES质粒为模板,扩增选择标记基因:新霉素抗性基因(neomycin)、增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),强启动子基因(CMV)和内部核糖体进入位点(IRES)序列; (3)将获得的两个选择标记基因(Neomycin和EGFP)以分别单独启动子表达的形式和IRES介入的同时表达的形式连接到含有目的片段的骨架载体上; (4)以(3)中获得的两个载体为骨架,替换掉Cre重组酶识别位点,得到另外两个只含有FLP重组酶识别位点的载体,成功共得到不同识别位点和不同蛋白表达方式的四种目的载体; (5)首次尝试以猪肾上皮细胞(PK15)为材料,转染上述四种质粒,G418筛选获得了稳定表达的单克隆细胞系,证明了构建的载体成功的表达了选择标记基因; (6)二次转染FLP重组酶质粒,传代3次后提取转染后细胞的RNA和对照组RNA,通过RT-PCR反应得到cDNA模板; (7)应用相对定量PCR反应验证选择标记基因删除前后在表达量上的变化,结果差异显(P<0.05)。 (8)流式细胞仪检测pCF质粒、pCF-pA质粒、pF质粒、pF-pA质粒删除效率分别为:21%、25%、18%、16%。


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