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TGEV/PRCV鉴别诊断方法的建立及TGEV N蛋白单克隆抗体的制备

范秀萍  
【摘要】: 猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一种高接触性传染病,主要引起一周龄以下仔猪发生呕吐、水样腹泻和死亡(死亡率通常为100%)。猪传染性胃肠炎流行遍布全世界,给养猪业带来了巨大的损失。猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus, PRCV)是TGEV的基因缺失变异株,其与TGEV核苷酸序列同源性达96%。TGEV和PRCV基因结构十分相似,抗原相关,产生的中和抗体有交叉反应,传统血清学方法很难将二者区分开。PRCV与TGEV相比,其S基因5’末端有大量碱基缺失,不同PRCV毒株的碱基缺失情况各不相同,缺失从621~681个碱基不等,并导致PRCV失去两个抗原位点。目前,各国PRCV感染现象呈现日益严重的趋势,并且常在TGEV感染猪群中发生,造成TGEV血清转阳现象,因此建立一种TGEV与PRCV的鉴别诊断方法尤其重要。 本研究根据已发表的PRCV基因组序列中的S基因序列和本实验室测定的TGEV华毒弱毒株的S基因序列进行比对分析,在S基因缺失区两端分别设计了两套引物P1、P2、P3、P4,以TGEV和PRCV细胞培养物为材料提取RNA,进行套式RT-PCR特异性片段扩增,TGEV P1、P2扩增片段大小为1338bp,P3、P4扩增片段大小为936bp,PRCV扩增片段分别为717bp、315bp。经过正交设计优化后建立的套式RT-PCR方法经过特异性、敏感性试验检测,只有TGEV与PRCV有特异性条带被扩增出,其他病毒(PEDV、PRRSV、SIV、PRoV、PRV、HCV)均未扩增出特异条带,TGEV与PRCV病毒最低检测量均为4 TCID50/mL,证明本法具有快速、特异和高度敏感的特点。 本研究还设计建立了环介导等温扩增方法用来鉴别区分TGEV与PRCV。根据已发表的PRCV基因组序列中的S基因序列和本实验室测定的TGEV华毒弱毒株的S基因序列进行对比分析,在S基因缺失区和共同区分别设计一套引物Q-FIP、Q-BIP、Q-F3、Q-B3与QX-FIP、QX-BIP、QX-F3、QX-B3,以TGEV与PRCV细胞培养物为材料提取RNA,进行特异性LAMP片段扩增,其中TGEV在Q系列引物扩增下会出现典型的LAMP梯度条带,Q系列引物扩增最小带为184bp,而PRCV在QX系列引物扩增时出现条带,片段大小194bp。经过正交设计优化后建立的LAMP方法经过特异性、敏感性实验检测,只对TGEV与PRCV扩增出现条带,而其他病毒(PEDV、PRRSV、PRoV)无条带出现,均为阴性。此方法可检测到的TGEV与PRCV病毒最低量为0.1TCID50/mL。证明本法具有快速、特异和高度敏感的特点。本方法采用美莱博公司的荧光染料SmartGreenⅠ与MgCl2进行肉眼及荧光可视检测,可以很容易的区分出阴阳性反应,方便现地检测病料。 上述两种方法的建立可以很好地鉴别诊断和区分TGEV与PRCV病毒,并且两种方法的特异性和敏感性都很高,相比较起来RT-LAMP方法比套式RT-PCR方法更敏感,且更适于现地病料检测。 本研究采用原核表达的TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,间接ELISA方法进行筛选,抗原为TGEV N蛋白。采用有限稀释法,经过四次克隆,最终获得三株抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞株(1A9、1G7、1H8)。三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚型均为IgG1型,杂交瘤细胞经过体外长期培养和冻存均未影响抗体的分泌。间接ELISA检测1A9、1G7、1H8细胞培养上清的抗体效价分别为1:640、1:320、1:800,腹水抗体效价分别为1:6400、1:6400、1:12800。用获得的单克隆抗体和SP2/0细胞培养上清为一抗,感染TGEV的ST细胞培养物为抗原进行间接免疫荧光实验,荧光二抗孵育作用后,与单克隆抗体作用的细胞培养物中,多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现强荧光,与SP2/0细胞培养上清作用未见出现荧光,结果表明,利用所制备的单克隆抗体进行间接免疫荧光对病原检测具有较高的特异性。用单克隆抗体与TGEV和TGEV N蛋白进行westernblot实验:荧光素二抗作用后用红外荧光扫描成效系统进行扫描,发现只在TGEV N蛋白处出现特异性条带,而TGEV病毒其他蛋白处未有特异性条带出现。结果说明,利用所制备的单克隆抗体进行westernblot对病原检测具有较高的特异性。 上述单克隆抗体的制备为下一步鉴别诊断TGEV/PRCV的阻断ELISA方法的建立打下了前期基础,为TGEV/PRCV的血清学诊断提供了材料。


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