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土壤多重抗生素抗性放线菌的筛选及其发酵产物的初步研究

王晓舟  
【摘要】: 放线菌的抗生素抗性筛选方法是一种很有效的开发放线菌生物活性物质产生潜力的方法,具有效率高、目的性强等优点,具有良好的研究和应用价值。本研究通过三重抗生素抗性法对土壤中分离得到的放线菌进行筛选,旨在为菌种筛选工作提供一条高效、简便的新路。 首先对内蒙古呼伦贝尔市、福建省仙游县、江西省丰城市以及浙江省富阳市内的4个样区所采集的土壤样品进行自然干燥等预处理后,采用含有2μg/mL青霉素及75μg/mL重铬酸钾的高氏一号培养基进行放线菌的初步分离。共分离得到20株放线菌。然后采用链霉素(Streptomycin)、庆大霉素(Gentamicin)及利福平(Rifampicin)三重抗性法对所得到的放线菌进行进一步筛选。最终得到一株放线菌,它对链霉素抗性为40μg/mL、庆大霉素抗性为10μg/mL、利福平抗性为150μg/mL。并初步命名为1号放线菌。 将1号放线菌进行发酵培养,并对其产生物活性物质的最佳适发酵天数进行研究,每隔24 h做镜检观察菌丝体生长情况,测定发酵液pH,测定生物量,并取不同天数的发酵液用于生物活性测定等试验。最终确定1号放线菌在该发酵条件下的最适发酵时间为10 d。 以枯草芽孢杆菌ATCC 6633(Bacillus subtilis)以及藤黄微球菌ATCC 9341(Micrococcus luteus)做为活性检测菌,用单层杯碟法测定1号放线菌的发酵液上清及菌体浸提液活性,用游标卡尺测其抑菌圈直径。结果得出:1号放线菌的发酵液上清及菌体沉淀浸提液对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌均有抑制活性,对藤黄微球菌的抑制活性大于枯草芽孢杆菌;发酵液上清活性大于菌体沉淀浸提液。 分别将发酵液上清以及菌体浸提液与本实验室自行表达纯化得到的天冬酰胺合成酶反应,测其对该酶的抑制活性。结果显示,1号放线菌的发酵液上清及菌体沉淀浸提液对天冬酰胺合成酶均显示了很强的抑制活性,发酵液上清活性大于菌体沉淀浸提液。 分别对发酵液上清以及菌体浸提液用不同温度处理不同时间以及调节不同pH值处理,测定处理前后的抑菌活性,以测定其活性物质稳定性。结果显示:该放线菌的发酵液上清在50℃水浴条件下处理1 h后,其抑菌活性基本丧失,而pH小于4或大于9的酸碱度处理也都会使其失活;相反,菌体浸提液经过90℃水浴1.5 h以及pH达到2和11的处理后其活性仍然稳定。 采用细菌基因组DNA的小量制备方法提取该放线菌DNA。经纯化后采用通用引物进行16SrDNA基因的PCR扩增。PCR产物测序后通过互联网,将序列提交NCBI数据库,应用Blast程序与数据库中已有的细菌16SrDNA序列进行相似性比较分析。结果表明:其同链霉菌Streptomyces griseus的相似性达到99 %。采用Clustalx1.81软件,用N–J法建立系统发育树进行分析并结合形态观察,进一步确定1号放线菌属于链霉菌属(Streptomyces)。


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