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猪链球菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因研究

赵志慧  
【摘要】: 猪链球菌(Streptococcus suis)根据菌体荚膜抗原特性的不同,分为1~34型及1/2型共35个血清型。其中1/2、1、2、7、9和14型均可引起猪只发病,其中以2型流行最广,对猪的致病性亦最强。猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的猪不同临床诊断类型传染病的总称。可致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎和局部脓肿,同时该病还可导致生猪从业人员感染和死亡,是一种重要的人畜共患病病原。抗菌药物在预防和治疗猪链球菌病过程中起着重要的作用,但同时也产生细菌耐药性不断增强的可怕后果。 四环素类抗生素是由链霉菌产生或经半合成制取的一类碱性广谱抗生素。能抑制革兰阳性菌及阴性菌,衣原体、支原体、立克次体及原虫等非典型性微生物的生长。近年来,随着四环素类抗生素不合理的应用,导致耐药菌不断的变异和增加,其耐药性的出现限制了它们的使用。为解决其耐药性问题,科研人员正着手进行四环素类抗生素耐药分子机制的研究,目前已证实其分子机制主要为抗生素外排或核糖体保护。但是,目前国内外就猪链球菌对四环素类抗生素的耐药机制研究较少,其耐药机制主要是由于TetM和TetO两种核糖体保护蛋白的产生,二者能依赖GTP将四环素从30S亚基水解下来从而耐药,且都是可转移因子。 本试验对从东北三省(黑龙江、辽宁、吉林)猪场采集的猪只鼻腔棉拭子进行分离、纯化,从中得到12株革兰阳性、链状球菌。通过生化鉴定及兰氏分群试验,结果表明12株菌株均为血清D型,共得到10种生化反应编码。利用K-B试验法进行猪链球菌对四环素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、复方新诺明、环丙沙星、青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素9种常用抗菌药物耐药性试验。结果表明所用菌株对9种常用抗菌药物表现为高度耐药,并且所有菌株都表现为多重耐药,耐药谱在4耐~9耐之间,以8耐菌株最多。以美国临床检验标准委员会(NCCLS)的临界浓度做为判断标准,采用微量稀释法判定了猪链球菌对强力霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素3种四环素类抗生素的耐药性。结果表明猪链球菌对强力霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素的耐药率很高,分别为100%、100%、91.7%,同时,细菌对三种四环素类抗生素的MIC50及MIC90均大于64μg/ml,耐药范围分别为4~64、16~64、2~64μg/ml。对12株猪链球菌进行昆明鼠致病性试验,结果显示高致病性的菌株共有6株,中等致病性的菌株共有5株,无致病性的菌株为1株。总致死率达到91.7%。 本研究利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增四环素类抗生素耐药基因,用以阐明东北三省分离的耐四环素药物的猪链球菌tetO、tetM基因的检出率、点突变及氨基酸突变与耐药的关系。结果为tetM基因检出率为100%、tetO基因检出率为0%。证明12株猪链球菌耐药主要是由核糖体保护蛋白中tetM基因介导,与tetO基因无关。而有无其他耐药机制还有待于进一步研究确定。tetM基因核苷酸序列与Genbank中同源序列的同源性达93%~100%。氨基酸位点突变主要集中在150~556位,其中432aa V→I是12株细菌共有突变,因此tetM基因的第432位是猪链球菌对四环素类药物耐药决定点。


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