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禽致病大肠杆菌生物被膜检测及形成基因研究

欧阳凤菊  
【摘要】: 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,并与许多病毒性疾病和其他细菌性疾病并发。随着集约化养鸡业的发展,大肠杆菌病的发病率和死亡率也随之增加,抗菌药物在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用,但随着抗菌药物的广泛应用,导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现,致病性大肠杆菌耐药现象又成为全社会关注的焦点。细菌生物被膜(bacterial biofilm, BF)作为细菌重要耐药的机制之一,细菌生物被膜广泛存在于自然环境中,具有极强的耐药性及免疫逃逸性,是造成临床慢性感染的主要原因之一。禽致病性大肠杆菌生物膜的形成与其耐药性的变迁和造成慢性感染有直接关系。禽致病性大肠杆菌生物被膜不仅造成抗菌药物在兽医临床上的治疗失败,也可通过食物链进入人体,对人类健康同样有着极大的威胁。 本试验从吉林省德惠地区养鸡场采集到疑似大肠杆菌病症状的58份样品中分离鉴定出47株禽致病性大肠杆菌(APEC),采用K-B圆纸片法对分离菌株进行卡那霉素敏感株的筛选。共筛选出3株卡那霉素敏感株。另对其他常用11种抗生药物进行敏感性测定,结果表明,分离株对所有药物均存在不用程度的耐药情况。其中耐药率最高的是四环素,高达97.87%;氨苄青霉素、哌拉西林、多西环素耐药率也较高,均在90%以上。且所有菌株均为多重耐药株,其多重耐药情况为少于七耐菌株占19.15%(9/47)、八耐菌株占10.64%(5/47)、九耐菌株占12.77%(6/47)、十耐菌株占19.15%(9/47)、十一耐菌株占21.27%(10/47)、十二耐菌株占17.02%(8/47)。 对3株卡那霉素敏感株进行生物被膜定性观察和定量检测表明APEC-8能形成强生物被膜,适合作为接合转移试验的受体菌。为后续试验方便筛选,对APEC-8进行宿主体外生物被膜形成条件的优化,确定其最适形成条件是37℃培养48h,培养基为5%TSB、粘附介质为U底96孔细胞培养板(材质为聚苯乙烯),Corning Costar公司产品。以改造的大肠杆菌E.coliβ2155(pUT-miniTn5-Km2)为供体菌与受体菌APEC-8进行双亲本滤膜转移接合杂交5次,构建五个转座插入突变体库,并传代3次获得稳定的接合子共计269个;PCR扩增鉴定具有卡那抗性的阳性菌株为193个;通过优化后的条件定量检测193株突变株的生物被膜形成情况,从中筛选出4株生物被膜缺陷突变株。利用基因组步移PCR技术扩增4株生物被膜缺陷突变株卡那抗性基因侧翼序列,测序比对后发现与APEC生物被膜形成有关的4个基因rfaG、flhE、OmpR、ycfM。


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