酪蛋白水解物的修饰及其生物活性变化

【摘要】： 酪蛋白不仅营养价值丰富,而且具有良好的功能性质,如溶解性、保水性、吸油性、乳化性、凝胶性等功能特性,还是生物活性肽(如:抗菌活性、抗氧化活性、降血压活性等)的重要来源,使酪蛋白广泛应用于食品及其它行业。利用酪蛋白为原材料,改善酪蛋白相关产品的功能特性与生物活性的研究,已经成为食品科学中的热点问题之一。 本研究采用三种蛋白酶对酪蛋白进行水解,制备酪蛋白水解产物,并分别对三种酪蛋白水解产物进行Fenton反应修饰和类蛋白反应修饰,测定其抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性的变化。主要研究结果如下: (1)利用Alcalase 2.4L FG蛋白酶水解酪蛋白,制备酪蛋白水解产物。选取底物浓度5%,pH8.0,酶添加量0.3AU/g蛋白质,50℃水浴中水解2 h得到水解度为10.0%的水解产物,其清除DPPH自由基的IC50值为2.802±0.072 mg/mL。对水解产物进行Fenton反应修饰,结果表明Fenton试剂添加量对水解产物羟基化程度影响显著,而反应时间对其影响不大。修饰产物的抗氧化活性提高,其清除DPPH自由基的IC50值降至0.891±0.017 mg/mL。 (2)采用Neutrase 0.8L蛋白酶水解酪蛋白,制备水解度为13.0%的酪蛋白水解产物,其对ACE的体外抑制活性IC50为40.35μg/mL。利用Neutrase 0.8L蛋白酶对水解物进行类蛋白反应修饰,并研究酶添加量、底物浓度、反应温度和时间对修饰反应的影响。结果表明,修饰反应体系中合成反应占优势,表现为游离氨基含量减少;酶添加量、底物浓度、反应时间对修饰反应的影响显著,而反应时间影响不大。利用中心组合设计和响应面分析法,优化类蛋白反应条件,以其游离氨基含量变化为响应值。软件分析得到游离氨基含量变化与酶添加量、底物浓度和反应时间的二次回归方程,最适反应条件为:反应温度为20℃,酶添加量3 kU/g蛋白质、底物浓度为62%(m/m)、反应时间6.3 h,此条件下反应体系中游离氨基含量变化达到210.01μmol/g蛋白质。对酪蛋白水解物进行不同程度的类蛋白反应修饰,得到5个不同修饰程度的修饰产物,它们的ACE抑制活性测定结果表明,修饰产物的ACE抑制活性随修饰程度的增加而提高,当反应体系中游离氨基减少量为210.01μmol/g蛋白质时,修饰产物的IC50值降低至14.72±0.22μg/mL。 (3)采用碱性蛋白酶水解酪蛋白,制备水解度为13.5%的酪蛋白水解物,其对ACE的体外抑制活性IC50为45.23μg/mL。利用中性蛋白酶对水解物进行类蛋白反应修饰,并研究酶添加量、底物浓度、反应温度和时间对修饰反应的影响。结果表明:修饰反应体系中水解反应为优势反应,表现为游离氨基含量增加;酶添加量、底物浓度、反应时间对修饰反应的影响显著,而反应温度的影响不大。在低酶添加量、高底物浓度和短反应时间下,修饰反应体系的游离氨基的增加幅度减少,水解反应相对降低。制备6个不同反应程度的修饰产物,ACE抑制活性分析结果显示,修饰产物的IC50降至15.56~19.98μg/mL,表明中性蛋白酶催化的类蛋白反应修饰,可以提高碱性蛋白酶制备的酪蛋白水解物的ACE抑制活性。