鸡SelN的体内分布及硒对其在肌组织中转录的调控

【摘要】： 硒是人和动物必需微量元素,在维持包括人在内的很多物种的正常生理功能中起着重要作用。硒与人、动物的健康密切相关,与一些疾病的发生如克山病、大骨节病及牲畜的白肌病密切相关。动物体内硒存在的主要形式是硒蛋白,硒主要通过硒蛋白发挥其生物学作用。研究发现,硒的摄入量与一些硒蛋白的变化相关,硒在一定程度调控硒蛋白。SelN是与人遗传性肌病相关的一种硒蛋白,其突变与肌肉紊乱联系在一起,可引起SelN相关肌病。SelN在胎儿组织中处于较高水平,在成人组织处于较低水平。在培养的成肌细胞中高表达,在分化成肌管时下调,表明SelN在早期发育和细胞增殖或再生中起作用。 目前关于SelN的研究主要集中在哺乳动物,尤其是在与SelN突变相关的人类遗传性肌病方面研究较多,而关于SelN在禽体内的组织分布、基因表达与调控研究还未见报道。本研究应用分子生物学技术克隆鸡的CDS区;利用基因工程技术在原核表达系统中表达了SelN并制备了多克隆抗体;应用半定量RT-PCR和Western blot方法检测了SelN在鸡体内的分布;然后分别以鸡、鸡胚、鸡胚成肌细胞为模型,通过给予不同水平的硒,采用荧光定量PCR方法,测定了不同硒水平对鸡、鸡胚的肌肉组织及体外培养的鸡胚成肌细胞中SelN及硒蛋白合成代谢相关酶SecS和SPS1 mRNA表达的影响,同时也检测了成肌细胞中Myf5、Pax7和MEF2A mRNA的表达水平,结果表明: 1.利用原核表达载体表达融合蛋白免疫新西兰白兔,成功制备出抗鸡SelN的多克隆抗体。 2.在舌、食道、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、小肠、盲肠、直肠、大脑、丘脑、脊髓、垂体、胸腺、法氏囊、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、睾丸、卵巢、胰腺、胸肌、翅肌、小腿肌、大腿肌、心脏等27个组织中均有SelN mRNA表达,在被检测的大脑、丘脑、脊髓、骨骼肌、心脏、肌胃、嗉囊、盲肠、脾脏、胸腺、法氏囊、肺脏、肝脏、肾脏、胰腺、睾丸和卵巢等17个组织中,除胰腺外均检测到SelN蛋白,因此SelN在鸡体内具有广泛的组织分布。 3.饲料中添加1、2、3、5mg/kg Na2SO3对育成公鸡肌肉组织硒含量及SelN、SecS及SPS1 mRNA表达均有影响,肌肉组织中,SelN mRNA表达整体呈低浓度增加高浓度减少的趋势,而SecS、SPS1 mRNA表达总体随硒浓度增加呈上升趋势。表明硒在转录水平调控SelN、SecS和SPS1 mRNA的表达,但高浓度硒毒性作用加大而使SelN表达有所减少。 4.高硒与缺硒状态对不同日龄鸡肌肉组织硒含量及SelN、SecS、SPS1 mRNA表达均有影响。高硒状态下,硒对SelN mRNA表达水平的调控对于不同肌肉组织及鸡不同日龄会呈现出不同的表达。缺硒组心肌中SelN mRNA水平受硒调控与日粮硒水平密切相关。骨骼肌中SelN mRNA水平高于正常对照组,即表达与硒水平相反。可能是由于SelN在骨骼肌中的重要性决定了其表达的优先性。此外,硒水平可影响SecS mRNA及SPS1 mRNA表达水平,但其表达水平的变化对于SelN表达的调控有待于进一步研究。 5.鸡胚注入不同浓度的硒,显著干扰了鸡胚肌肉组织中的SelN、SecS、SPS1 mRNA表达水平,21日龄时胸肌和腿肌的对照组及加硒组SelN、SecS、SPS1mRNA表达均显著减少,加硒的影响很小。提示这些基因转录受到硒含量的调控,但其确切机制有待于进一步研究。 6.成肌细胞在体外培养不同时间的增殖和分化过程中及加硒均可可引起各基因mRNA表达水平的改变。其中SelN mRNA表达水平变化表现在增殖的细胞中表达显著增加,在分化过程中表达下降。Myf 5、Pax7和MEF2A mRNA表达水平变化与细胞增殖分化相关。加硒可以影响SelN、SecS和SPS1mRNA以及Myf5、Pax7和MEF2A mRNA表达水平,且整个培养过程中SelN mRNA表达水平变化与Myf5、Pax7和MEF2A mRNA表达水平的变化有相关性。提示这些基因转录受到成肌细胞增殖分化状态及硒含量的影响,但其确切机制有待于进一步研究。 7.从鸡胚12日龄开始至雏鸡35日龄的发育过程中,心肌中SelN mRNA表达水平随日龄的增加呈现不明显的波动性变化,胸肌、腿肌中胚胎时其表达水平较高,出生后显著下降,提示SelN在鸡胚骨骼肌中发挥重要作用。SecS及SPS1mRNA表达水平与SelN mRNA表达水平变化相同,提示三种基因在鸡发育不同时期及不同组织发挥着不同的作用。综上所述,鸡SelN转录水平和蛋白水平在体内均有广泛的组织分布,硒在转录水平调控SelN、SecS和SPS1 mRNA的表达。成肌细胞中SelN mRNA表达水平变化与Myf5、Pax7和MEF2A mRNA表达水平的变化呈正相关;发育过程中骨骼肌中基因转录水平的显著下降,提示SelN在胚胎肌肉早期发育中发挥重要作用。