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白桦Bpl4CLs基因家族的分离及转录表达分析

戴超  
【摘要】:4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是苯丙烷途径中的关键酶,为植物体提供大量的次生代谢物质,如木质素、类黄酮等。在木质素合成过程中,4CL是联系木质素前体和各个分支反应的纽带,分别催化咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和阿魏酸生成相应的CoA酯。 本研究利用RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白桦的Bpl4CL2和Bpl4CL3基因,cDNA全长分别为2069bp和1974bp,ORF分别为1629bp和1656bp,分别编码543个和552个氨基酸。 利用生物信息学手段对Bpl4CLs基因所编码的氨基酸序列进行结构及功能预测的结果证实,Bpl4CL3蛋白在Bpl4CL1、Bpl4CL2和其他物种都保守的基序位置出现了差异,可能代表其具有控制木质素合成之外的其他生物学功能。 克隆得到了三个Bpl4CLs基因的DNA全长:Bpl4CL1的DNA全长为1755bp,在cDNA序列的1194与1195之间插入了一个126bp的内含子;Bpl4CL2的DNA全长3185bp,在cDNA序列的1553与1554之间、1658与1659之间插入了318bp和798bp的内含子;Bpl4CL3的DNA全长为3280bp,分别在cDNA序列的1333与1334之间、1480与1481之间、1546与1547之间插入758bp、173bp、283bp的内含子。 为确定白桦4CLs基因表达分析实验中的内参基因,采用半定量RT-PCR技术分析白桦持家基因18S rRNA、肌动蛋白基因Actin、泛素基因Ubiquitin和微管蛋白基因Tubulin在白桦中的表达。结果表明,18S rRNA, Actin及Ubiquitin基因在各样本间的表达无显著差异,说明这3个基因可作为校正白桦目标基因表达量的参照基因。 选取Actin作为内参基因,采用荧光实时定量PCR技术对Bpl4CLs在白桦不同时期及不同部位的表达进行了分析,证明Bpl4CL3在成熟部位中的表达量较高,而Bpl4CL1在幼嫩部位中的表达量要高于成熟部位,Bpl4CL2在雄花中的表达量最高。


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