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羽衣甘蓝ARC1相互作用蛋白及授粉过程中差异表达蛋白的研究

杨佳  
【摘要】:自交不亲和性(Self-incompatibility, SI)是芸苔属植物重要的生殖保障,具有避免自交、促进异交的作用。芸苔属植物SI不仅是植物细胞识别、信号转导的模式系统,而且在植物生殖生物学研究中具有重要的意义。近年来,人们对芸苔属植物柱头-花粉之间SI识别有了较深入的认识,但对于柱头乳突细胞内SI信号传递的机制,以及抑制自己花粉生长的机理仍需要进一步地阐释。本文以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)为试验材料,对SI进行了如下方面的研究: 1.羽衣甘蓝BoExo70A1的分离及与ARC1的相互作用 采用RT-PCR及RACE方法从花期柱头中分离出羽衣甘蓝BoExo70A1。BoExo70Al全长cDNA序列为2184bp,包含56bp的5’非编码区、211bp的3’非编码区和一个长度为1917bp的开放读码框(ORF),对应编码一个含有638个氨基酸残基的蛋白质。BoExo70A1基因DNA序列全长4076bp,含有12个外显子和11个内含子,内含子的大小范围在74bp到453bp之间,内含子5’供体位点和3’受体位点边界序列符合GU-AG规则。在氨基酸序列比对中,BoExo70A1与油菜BnExo70A1、拟南芥AtExo70Al分别具有99%和94%的一致性。蛋白结构域分析结果显示,BoExo70A1蛋白的C末端含有一个典型的Exo70结构域。 Southern杂交结果显示,BoExo70A1在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝。Northern杂交分析表明,BoExo70A1在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中都有表达,在叶中表达量最低,在茎和花瓣中表达量较高。在酵母双杂交分析中,BoExo70Al的N末端(BoExo70A11-270)和BoARC1N末端的UND结构域(BoARC11-279)介导了两者之间的相互作用。 2.JDP1的分离及与ARC1的相互作用 通过酵母双杂交系统筛选羽衣甘蓝柱头cDNA文库,获得与ARC1相互作用的蛋白JDP1(J domain-containing protein1)。 JDP1全长cDNA序列为1326bp,包含73bp的5’非编码区、218bp的3’非编码区和一个长度为1035bp的开放读码框,对应编码一个含有344个氨基酸残基的蛋白质,相对分子质量约为38.4kD,理论等电点为7.04。蛋白结构域分析显示,JDP1的N端含有一个J结构域,而C端未在数据库中找到相似的结构域。JDP1的mRNA在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中均检测到表达;而且JDP1蛋白也在茎、叶、花瓣、花药、子房、花柱和柱头中表达,并且在柱头发育的早期阶段表达量较低;但随着柱头的发育JDP1的表达量增高。 通过原核表达纯化,获得MBP-ARC1融合蛋白和His-JDP1融合蛋白,通过体外结合发现JDP1能够与ARC1发生相互作用。此外,在酵母双杂交及亚细胞共定位分析中,JDP1的C端(JDP159.344)介导了与ARC1的相互作用,而且JDP169-344能够影响BoARC1的定位,使其从细胞质运输到细胞膜上;但JDP1的N端抑制与ARC1的相互作用。通过酵母双杂交的进一步分析,鉴定出JDP1的第八位点的酪氨酸(Tyr8)是控制与ARC1相互作用决定位点。 3.自交及异交授粉过程中柱头差异表达蛋白的研究 采用TCA-丙酮法分别对羽衣甘蓝S13-bSl3-b自交不亲和系自交授粉0h、0.5h、1h、1.5h以及S13-bS13-b×14号异交亲和授粉0h、0.5h、1h、1.5h柱头蛋白样品进行提取。蛋白经过纯化与定量后,采用CyDye DIGE最小标记法对蛋白样品进行荧光标记,蛋白在24cm、 pH4-7的IPG胶条及12.5%的SDS-PAGE上得到分离。 在自交授粉后的柱头中,共有38个差异表达的蛋白,其中11个蛋白质上调表达,27个蛋白质下调表达;在异交授粉后的柱头中,共有16个差异表达的蛋白,其中6个蛋白质上调表达,10个蛋白质下调表达。鉴定的差异表达蛋白涉及多个重要的生物学功能,包括:物质代谢、光合作用、能量代谢、蛋白折叠与降解、信号转导、细胞结构、细胞壁构建与代谢、胁迫和防御。在自交授粉后的柱头中,差异表达蛋白被分为8类,在异交授粉后的柱头中,差异表达蛋白被分为7类。在自交授粉后的柱头差异表达蛋白中物质代谢和光合作用相关蛋白所占比例最大,分别为36%和19%;而在异交授粉后的柱头差异表达蛋白中物质代谢和能量代谢相关蛋白所占比例最大,分别为26%和20%。上述差异蛋白的鉴定与分析为认识SI发生的分子机制提供了重要的线索。


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