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疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)NF-05漆酶的产生、特性及应用研究

赵丹  
【摘要】:漆酶,即p-对苯二酚:双氧氧化还原酶(laccase,p-diphenol:dioxygen oxidoreductase, EC1.10.3.2),是一种多酚类氧化还原蛋白,属于蓝多铜氧化酶家族(blue multicopper oxidoreductase, BMCOs)。本研究从伊春凉水国家级自然保护区土壤样品中分离到一株漆酶高产真菌,纯化了胞外漆酶蛋白,考察了生化、酶学、光谱学及电化学性质,并进行了转化芳香类化合物及降解合成染料的应用研究,获得主要结果如下: (1)漆酶高产真菌的分离鉴定 从土壤样品中筛选到一株具有胞外漆酶活性的真菌NF-05,菌丝白色绒毛状呈同心轮状扩散生长,分生孢子由黄色至淡绿色,最终为墨绿色胶黏团块状;显微形态分生孢子宽梭状,分生孢子梗单生或丛生,顶端帚状分枝较多,边缘菌丝卷曲状分枝,壁有疣状突起,分生孢子座座状或浅杯状,为半知菌亚门(Deuteromycotina)漆斑菌属(Myrothecium. sp)真菌;rDNA-ITS序列片段长度544bp,在NCBI数据库进行BLAST比对分析(accession number HM347341),结合形态学研究结果,鉴定为疣孢漆斑菌(M.verrucaria)。 (2)产酶条件的优化 M.verrucaria NF-05在产酶基础培养基中发酵至第五天达到产酶高峰,初始酶活8.38U/ml,菌丝生长与胞外漆酶分泌部分耦合。菌株产酶最适碳源为4%葡萄糖,3%蛋白胨,培养基初始pH值7.0,装液量60ml/250ml,接种量4%,最适培养条件为30℃下140rpm振荡培养,没食子酸及Fe3+对菌株产酶有显著促进作用,NF-05产酶水平提高至12.82U/ml。响应面法(RSM)优化中PB设计结果表明葡萄糖、Cu2+和没食子酸对菌株产酶有显著影响,经最陡爬坡试验及中心组合试验(CCD),葡萄糖浓度为26.47g/l,Cu2+和没食子酸浓度分别为236.3μM和138.4μM时,模型拟合方程有极大值19.82U/ml,是初始酶活的2.37倍。 (3)胞外漆酶的诱导 Cu2+在0.1-4mM范围内对NF-05胞外漆酶有显著诱导作用,最优浓度为0.2mM,发酵液漆酶活性43.23U/ml;16种供试酚类对菌株产酶有明显诱导作用,阿魏酸效果最好,酶活达到234.15U/ml;14种显著诱导菌株产酶的胺类物质中,3,3-二甲基-4,4-二氨基联苯使酶活提高至258.11U/ml;6种非酚胺类漆酶底物也对NF-05漆酶产生有显著诱导效果,木质素磺酸钠浓度为1mM时,发酵液漆酶活性为267.92U/ml,是目前报道的真菌漆酶活性最高值;4种染料显著诱导产酶,偶氮类丽春红效果最好,酶活从对照处理的43.23U/ml提高至61.16U/ml。 (4)蛋白的纯化与鉴定 以M.verrucaria NF-05发酵液为粗酶液,采用硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化,经SDS-PAGE和native-PAGE检测,目的片段为单体蛋白,具有漆酶活性,分子量66kDa。N端10个氨基酸序列为APQISPQYPM,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-/MS)对肽段序列的比对分析,鉴定所获M.verrucarid NF-05胞外目的蛋白为漆酶蛋白。 (5)光谱学特性 经电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)测定,每个M.Verrucaria NF-05漆酶蛋白分子含铜离子3.08±0.3个,铁离子0.95±0.2个,二者比例为3:1。目的蛋白在300-650nm波长范围内全扫描,无特征吸收峰,顺磁共振(EPR)也未检测到磁性信号。我们推断M.Verrucaria NF-05漆酶蛋白中铜离子处于正一价态,全满状态的d10核外电子排布,不能产生d-d跃迁,易于电子传递,是造成光谱学“静默”的原因,也赋予NF-05漆酶异常高的酶活性。NF-05漆酶蛋白是一种活性中心金属组分及光谱学特性不同与已知报道的新白色漆酶。 (6)酶学特性 M.Verrucaria NF-05漆酶最适作用pH值4.0,最适作用温度40℃;Na+、 Mn2+、Cu2+和Zn2+对漆酶活性有显著促进;在5%供试有机溶剂中,漆酶活性保持在50%以上,常规蛋白抑制剂L-半胱氨酸、SDS、DTT和NaN3浓度为1mM时,酶活性基本丧失;卤族元素阴离子是供试漆酶特异性抑制剂;与常规漆酶底物ABTS亲和性较好,Km值为85.9μM。 (7)对合成染料的脱色与降解 偶氮类染料中,NF-05漆酶对橙黄Ⅰ和甲基橙脱色效果最好,无介体参与反应8天后脱色率即可达到90%以上;TE、VA和HBT对橙黄G6、ACE对苋菜红有明显促进脱色效果,脱色率达到90%以上。介体的参与可小幅提高NF-05漆酶对供试蒽醌类染料的脱色效率。芳甲烷类染料中碱性品红脱色效果最好。无介体参与并增大漆酶浓度后,反应10min时橙黄Ⅰ、铬黑T、碱性品红和苯酚红的特征吸收峰即完全被降解。 (8)对芳香酚胺的转化 NF-05漆酶对没食子酸等14种酚类底物、对氨基-N,N-二甲基苯胺等15种胺类底物及ABTS等6种非酚胺类底物的催化效率均高于两种对照商品酶。 (9)电化学性质 在充氮条件下,M.Verrucaria NF-05漆酶直接吸附于GP和GC裸电极上,与电极间均可进行直接电子转移,发生可逆的电化学反应;对过氧化氢的电催化还原效率均高于对照商品漆酶和胆红素氧化酶,过氧化氢氧化还原起始电势与裸电极相比均有明显正移。


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