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真菌多糖诱导肝癌细胞系凋亡的初探及对EHV-1疫苗的免疫调节作用

王贵宾  
【摘要】:肝细胞癌症已成为全球常见的肿瘤疾病,尤其在亚洲和非洲,发病率和患病率极高。数据显示,肝细胞癌的发病率已占到人类癌症总发病率的6%,位居第三位,已成为阻碍人类健康的主要问题。原因之一在于肝癌细胞具有高的侵袭性,导致肝癌具有高度转移性。癌症的转移存在许多内部机制的相互作用,包括细胞增殖失控、侵袭到周边组织、侵袭到人类机体的远端以及粘附,侵袭和依附到其它器官和组织上。肿瘤的生长和转移需要新生的血管,这些血管的萌发来自于毛细血管。因此,抑制癌细胞的增殖、侵袭以及癌细胞之间介导新生血管的新生,将会抑制癌症的转移以及进一步提高肝癌患者的生存。 桑黄、灵芝和黑木耳都属于担子菌,主要生长在亚洲和美洲,在传统的东方医学体系中,药用真菌已得到显著的认可。从药用真菌中分离到的生物活性物质如多糖和以α-和β-糖苷键相连的蛋白杂聚糖。这些复杂的多糖化合物已从许多真菌物种中分离出来,并证明具有免疫刺激和抗癌活性以及可以刺激T淋巴细胞的增殖、激活B淋巴细胞以及诱导来源于树突状细胞的成熟骨髓瘤细胞的功能。本课题组已经通过电镜观察凋亡小体及流式Annexin V-FITC/PI染色等方法证明了桑黄粗多糖可诱导HepG2细胞凋亡,并阐述了桑黄粗多糖诱导HepG2细胞凋亡的作用与Bax的表达增加、抑制Bcl-2的表达,从而改变Bcl-2/Bax比例有关。基于以上原因,本研究应用桑黄多糖(PL)、灵芝多糖(GL)和黑木耳多糖(AA),初步探讨了三种真菌多糖抑制肝癌细胞系HepG2和Bel-7404细胞增殖的分子机制以及作为生物调节剂对于疫苗免疫后小鼠的免疫调节作用。本研究分以下几个部分。 (1)应用水提沉醇的方式获取桑黄粗多糖,并应用硫酸苯酚法、DNS法和BCA法测定各种成分的含量,采用DEAE-Sepharoes F.F.离子柱层析和Sephacryl S-200凝胶柱层析方法进行纯化,获得均一多糖,并采用体外淋巴细胞增殖实验检测组分的活性。结果:桑黄多糖PLP-B1组分具有体外生物学活性; (2)应用具有活性的桑黄PLP-B1组分,采用细胞增殖、细胞活性、细胞粘附与侵袭等试验验证该物质是否可以抑制HepG2细胞。结果:桑黄多糖PLP-B1组分可以有效抑制HepG2细胞的增殖、粘附和侵袭特性; (3)应用桑黄PLP-B1组分做细胞周期和细胞凋亡试验,验证该物质是否能引发HepG2细胞产生凋亡。结果,桑黄多糖PLP-B1组分可以诱导HepG2产生凋亡及致使HepG2细胞阻滞于S期而显著抑制HepG2细胞的增殖和细胞集落的形成; (4)应用桑黄多糖(PL)作为免疫调节剂,验证是否在疫苗免疫中具有免疫调节作用。试验包括抗体检测,CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞百分率以及组织切片HE染色等。结果:桑黄多糖(PL)可以提高免疫组的抗体效价,并保持机体抗体水平的持续增长,HE染色结果也表明在正常范围内,证实高剂量的桑黄多糖可以提高机体的免疫力。外周血中CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞的检测结果,证明桑黄多糖可以刺激机体的淋巴细胞的数量增殖,并具有机体免疫调节作用; (5)应用桑黄多糖(PL)、灵芝多糖(GL)和黑木耳多糖(AA),采用细胞增殖和软琼脂试验,验证三种多糖是否可以抑制HepG2和Bel-7404细胞的增殖。结果:三种多糖对于HepG2和Bel-7404两株肝癌细胞系细胞具有显著的抑制癌细胞增殖的作用; (6)应用桑黄多糖、灵芝多糖和黑木耳多糖,采用细胞凋亡、细胞周期和Westernblot试验验证三种多糖抑制HepG2和Bel-7404细胞的增殖和细胞凋亡的分子机制。结果:三种多糖通过诱导细胞产生凋亡和阻滞癌细胞于G1和/或S期而抑制癌细胞的增殖。诱导的机制包括通过下调AKT激酶磷Thr308或/和Ser473两个磷酸化位点而激活AKT活性,从而激活PI3K/AKT信号通路;激活Bcl-2家族中制约蛋白的比率从而改变线粒体膜的通透性,释放凋亡因子细胞色素C和Smac诱导细胞产生凋亡,从而激活线粒体信号通路;通过上调p27Kip或/和p21cip的表达量,抑制cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2两个复合物的活性,阻滞癌细胞于G1和/或S期而抑制癌细胞的增殖。 (7)应用三种真菌多糖处理HepG2肝癌细胞,提取总蛋白,应用双向电泳技术对处理组和正常细胞的蛋白质表达图谱进行了对比分析,经质谱鉴定并结合生物信息学分析,共鉴定出59个差异表达的蛋白,通过Western blot和Real time PCR两种方法验证其中两个蛋白点。


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