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欧美山杨插穗不定根发育的诱导期和伸长期数字表达谱分析

冷淑娇  
【摘要】:欧美山杨是我国重要速生用材和生态造林树种,能够快速地恢复森林生态环境,发挥出森林的多种效益。但是欧美山杨扦插生根率低一直是困扰林木育种工作者的难题。近年来,杨树全基因组的序列被破解,部分与生长发育相关基因的表达模式已清楚,这使研究工作者具备了从分子水平上探究林木生长发育机制的条件。 本研究以欧美山杨插穗为材料,观察扦插过程中不定根发育所发生的形态解剖变化,选取两个重要的发育阶段(不定根发育的诱导期和伸长期)和插穗的不同部位(不定根起始部位和茎叶部位),利用solexa高通量测序技术获得与不定根发育相关的基因,分析部分基因的表达情况以及所参与的生物代谢过程。并通过实时荧光定量PCR技术验证测序结果的可靠性。最终,从理论上探讨插穗生根的分子机制,为林业基因工程育种提供科学依据。研究结果如下: (1)在形态解剖学研究中发现:欧美山杨插穗在扦插0天时,具有完整的解剖结构;6天左右时,韧皮部的薄壁细胞分裂加速,在外部形态上表现为插穗末端膨大变粗;9天左右时,细胞继续分裂并呈现明显的分层,这时根原基已经形成,在外部形态上表现为插穗末端有多处乳白色突起的根;12天左右时,根原基继续分裂伸长,形成具有完整根冠、分生区和伸长区的根。 (2)分析solexa测序数据发现在欧美山杨插穗不定根发育的过程中,拷贝数大于100的Tag占Tag总量的60%以上,而在Tag种类中不到3%;低拷贝的Tag(1-5拷贝)占Tag总量只有8%左右,而在Tag种类中占有的比例达到80%以上。这意味着某些高表达量的基因很可能在欧美山杨不定根发育过程中起着重要的作用。 (3)对solexa测序得到的标签文库进行比对分析,筛选差异表达的基因并对其进行功能分类。参考文献挑选部分根发育相关的基因统计在不定根发育的不同时期和不同部位的表达情况,并构建这些基因之间的亲缘关系进化树,分析在不定根发育过程中具体发挥的作用。重点对不定根起始部位在发育诱导期和伸长期存在差异的基因(I-L vs E-L)进行Parthway显著性富集分析,确定差异表达基因主要参与的生化代谢途径和信号转导途径。 (4)随机选取12个根发育相关基因,通过实时荧光定量PCR技术检测solexa测序结果的可靠性。通过对比分析发现:12个基因在两种实验技术中的表达趋势基本一致,只是由于计算方法和处理方式不同,使得同一基因在不同样品之间的差异倍数有所区别。另外,还利用实时荧光定量PCR和半定量PCR技术筛选出ACTIN39(actin alfa-39chain)基因在欧美山杨中表达量较为稳定,可以作为内参基因用于其它方面的研究。


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