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杨树FLC基因的研究—杨树FLC基因家族的生物信息学分析及小黑杨PnFLC1基因的克隆和表达分析

郑美珠  
【摘要】:模式植物拟南芥的成花诱导途径研究得已经很清楚,拟南芥FLC (Flowering LocusC)基因在成花诱导途径中处于枢纽位置,是春化途径和自主途径的关键基因,FLC上调表达可以抑制下游基因SOCl和FT的表达,从而抑制开花,反之FLC下调表达促进开花。杨树是否也存在着和拟南芥相似的成花途径,杨树中FLC基因的功能和开花的关系如何,有待于研究。针对上述问题,进行如下研究: (1)生物信息学方法在杨树全基因组中鉴定了FLC基因家族的13个基因成员,蛋白质序列分析表明,13个基因的蛋白序列都具有MADS-box家族典型的M结构域,一些基因还分别具有I、K、C结构域。染色体定位分析显示,PtrFLC-10(745710)和PtrFLC-11(678188)位于scaffold上,其他11个基因分布在9条染色体上。表达聚类分析表明,每个基因在不同组织表达具有差异性。 (2)筛选出拟南芥早花突变体flc植株的纯合体21株,该突变体与野生型相比早花约7天,此突变体SALK_103719.45.30.x被敲除的基因FLC (Genebank Accession:NM_121052)与杨树FLC基因家族中的PtrFLC-13(758707)编码的蛋白相似度达49%,以PtrFLC-13基因序列设计引物,克隆出小黑杨中的PnFLCl基因,全长726bp,与PtrFLC-13仅存在3个碱基的差异,在蛋白序列上完全一致。实时荧光定量PCR显示,该基因在花芽中表达量最高,其次为茎、叶,在根中的表达量最低,春化作用处理后,该基因在根、茎、叶组织中的表达量均下降。 (3)成功构建pET52b-PnFLCl原核表达载体,转化至BL21菌株后,确定了融合蛋白的最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为8h。用此重组质粒制备得到的多克隆抗体与原核表达的融合蛋白western blot杂交,检测抗体具有特异性。 (4)用酶切、连接方法构建了pROKⅡ-PnFLCl植物过表达载体,利用Gateway技术构建了RNAi抑制表达载体,经测序鉴定后,进一步将两种质粒分别转化至农杆菌EHA105,保存阳性单克隆,为下一步杨树的遗传转化奠定基础。


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