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蛹虫草富硒条件培养优化及硒多糖活性机理的研究

赵博  
【摘要】:蛹虫草[Cordyceps militaris(Vuill.)Fr.]既是我国传统名贵中药材,也是重要的林下食用菌资源,具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫等诸多药理作用。硒是人体必需的微量元素,缺硒会导致人体发生多种疾病,而硒缺乏在世界各地普遍流行。由于有机硒易于被动物吸收,具有较高生物利用率及毒性阈值等优点,已经得到了人们广泛关注。蛹虫草具有良好的富硒能力,是珍贵的富硒食药用菌,硒多糖兼具硒和多糖的生物活性,可作为理想的硒膳食补充剂进行研发。为此,本论文以蛹虫草为研究对象,通过添加无机硒对富硒蛹虫草培养基配方及栽培条件进行优化,以获得蛹虫草富硒栽培技术。在此基础上,研究了富硒蛹虫草子座及蛋白质中硒的分布规律,对硒多糖提取工艺进行优化,并研究了硒多糖分离纯化和结构表征,同时对硒多糖抗氧化活性及体内免疫调节活性进行了研究,为富硒蛹虫草的开发利用提供了理论依据,主要研究结果如下:(1)以富硒蛹虫草产量和硒含量为指标,采用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计方法,对影响栽培效果的9个因素进行筛选,对关键因素进行优化,得到富硒蛹虫草最佳栽培培养基配方:葡萄糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、硫酸镁1.5 g/L、柠檬酸三铵1 g/L、维生素B1 50 mg/L、亚硒酸钠添加量240 mg/L、小麦600 g/L;最佳培养条件:常温浸泡26 h,发菌培养温度18℃,原基诱发温度16℃,子座生长温度22℃;在此条件下,富硒蛹虫草产量为175.57 g/kg,子座硒含量为197.32μg/g。与普通蛹虫草栽培相比,其产量、多糖及虫草素含量分别提高了 9.04%、24.06%、69.42%。硒含量提高了 52.86 倍。(2)依据富硒蛹虫草的生长曲线,对富硒蛹虫草子座和蛋白质中硒的分布规律进行了研究,研究结果表明:蛹虫草子座硒产量、硒含量、蛋白硒含量、蛋白硒占总硒比均随着硒添加量的增加而增加,但蛋白硒占总硒比各处理组间差异不显著(p0.05);相同硒添加量条件下,不同时期子座硒产量随蛹虫草的生长而增加,子座硒含量先下降后上升,在成熟期蛹虫草子座硒含量显著提高,蛋白硒含量和蛋白硒占总硒比呈下降趋势(p0.05);富硒可显著提高蛹虫草碱溶性蛋白含量(p0.05),而高硒添加量(120 mg/kg)可显著降低水溶性、盐溶性及醇溶性蛋白在子座中含量(p0.05),且随着蛹虫草的生长4种蛋白组分含量逐渐降低;硒在4种蛋白组分中分布呈不均衡性,硒含量顺序为碱溶性蛋白水溶性蛋白盐溶性蛋白醇溶性蛋白,但水溶性蛋白对硒具有更大的承载能力;富硒蛹虫草不同分子量蛋白与硒结合量具明显的负相关。(3)采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法,应用水提法、微波提取法及超声波-微波联合提取技术对富硒蛹虫草硒多糖提取进行优化,得富硒蛹虫草硒多糖超声波-微波联合提取最佳工艺:超声时间26.0 min、微波时间3.2 min、微波功率350 W、液料比32 mL/g,在此条件下,硒多糖提取率达5.05%。超声波-微波联合提取法具有提取时间短,提取率高,硒多糖抗氧化活性强等优点,是硒多糖提取最优方法。(4)利用DEAE-52和Sephacryl S-400层析柱纯化得3对普通多糖及硒多糖,分别为 Se-/CMP-Ⅰ、Se-/CMP-Ⅱ、Se-/CMP-Ⅲ,且 Se-/CMP-Ⅲ 在子座中含量最高;HPSEC分析结果表明,除Se-/CMP-Ⅰ外,Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ为多糖均一级分,平均分子量基本一致;硒及糖醛酸含量测定结果表明,三个硒多糖级分硒含量依次为Se-CMP-ⅢSe-CMP-ⅡSe-CMP-Ⅰ,硒在高分子量级分中分布较多,且Se-/CMP-Ⅰ和Se-/CMP-Ⅱ及Se-/CMP-Ⅲ糖醛酸含量不存在显著差异(p0.05);单糖组成富硒表明,Se-/CMP-Ⅱ主要由甘露糖、半乳糖及葡萄糖组成,Se-/CMP-Ⅲ为葡萄糖组成的均质多糖,且CMP-Ⅱ与Se-CMP-Ⅱ单糖摩尔比一致;红外光谱、1HNMR及13CNMR分析结果表明,富硒未改变Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ主体结构,Se-CMP-Ⅱ中硒可能通过0-6取代连接到碳骨架中,且取代发生位点主要发生于其支链的末端β-D-Glcf-(1→残基上,并以硒酸酯形式存在,在Se-CMP-Ⅲ结构中除0-6取代外,硒还可能是以取代→6)-α-D-Glcp-(1 →的C-6或→4)-α-D-Glcp-(1→残基的C-2上的-OH形成的结构形式存在。(5)为研究硒多糖构效关系,对Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ体外抗氧化活性进行了研究。研究结果表明:富硒蛹虫草与普通蛹虫草相比,Se-CMP-Ⅱ和Se-CMP-Ⅲ总还原力、·OH自由基及ABTS+自由基清除率均显著高于CMP-Ⅱ和CMP-Ⅲ(p0.01);Se-CMP-Ⅱ较CMP-Ⅱ对O 2-自由基清除率差异不显著(p0.05),但Se-CMP-Ⅲ较CMP-Ⅲ对O 2-自由基清除率差异显著(p0.01)。(6)在D-半乳糖诱导下构建亚急性衰老动物模型,对Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ体内抗氧化活性进行对比分析,研究结果表明:随着Se-CMP-Ⅲ剂量的增加,小白鼠体重、T-AOC、T-SOD、GSH-Px及CAT活性随之增加(p0.05),而肝、肾、心及血清中的MDA含量降低(p0.05),且Se-CMP-Ⅲ活性优于CMP-Ⅲ,从而说明含硒基团的引入可显著提升CMP-Ⅲ的抗氧化活性,富硒蛹虫草Se-CMP-Ⅲ是一种潜在的抗氧化和抗衰老功能食品资源。(7)利用环磷酰胺构建小白鼠免疫抑制模型,对Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ免疫调节活性进行评价,研究结果表明:Se-CMP-Ⅲ对环磷酰胺诱导的小白鼠免疫机能下降具有明显的缓解作用,可显著提高小白鼠体重、脾脏及胸腺指数、外周血白细胞数、血清Ig G、Ig A、IgM含量、巨噬细胞吞噬指数、脾淋巴细胞增殖能力(p0.05),同时可显著提高脾、外周血淋巴细胞CD4+/CD8+值,并可改善环磷酰胺造成的肝损伤。采用ELISA法对血清TNF-α IL-6、IL-2及IFN-γ含量进行测定,表明Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ能够显著提升血清中4个细胞因子水平(p0.05)。在相同剂量下,与CMP-Ⅲ相比,Se-CMP-Ⅲ具有更高的免疫调节活性,说明含硒基团是Se-CMP-Ⅲ发挥免疫调节活性的重要结构元件之一,Se-CMP-Ⅲ可作为一种新型的免疫调节剂资源进行研发。


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