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星星草(Puccinellia tenuiflora)应答H_2O_2的生理与氧化还原蛋白质组学研究

喻娟娟  
【摘要】:各种环境逆境都会对植物造成氧化胁迫,研究植物氧化胁迫应答分子调控网络机制具有重要意义。星星草(Puccinellia tenuiflora)是我国北方盐碱地广泛分布的耐盐碱牧草,其盐碱应答生理生态学机制已经被广泛研究。我们的前期研究表明,星星草具有应答盐碱胁迫的特殊信号与代谢机制,但是对其应答盐碱造成的氧化胁迫的分子调控网络并不清楚。本研究通过外源施加H2O2模拟盐碱胁迫造成的氧化胁迫,进而利用氧化还原蛋白质组学方法与分子遗传学手段相结合,分析了星星草氧化胁迫应答的分子生理学机制。通过对蛋白质自由疏基含量、光合特性、叶绿素荧光参数和活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除系统的分析,我们发现氧化胁迫对星星草造成了氧化损伤,导致蛋白质自由巯基含量的下降,抑制了星星草的光合速率;并且调控多种抗氧化酶的活性与非酶抗氧化剂的含量应答氧化胁迫。氧化还原蛋白质组学研究表明,在氧化胁迫(5 mM和10 mM H2O2处理6 h)条件下,星星草叶片中62种蛋白质丰度增加,58种蛋白质丰度减少;并且70条肽段氧化水平上升,51条肽段氧化水平下降。同时,游离叶绿体的氧化胁迫(5mM和10mMH2O2处理10 min)结果表明,叶绿体中85种蛋白质丰度增加,58种蛋白质丰度减少;并且20条肽段氧化水平上升,20条肽段氧化水平下降。这些蛋白质的丰度与氧化还原水平变化模式表明,Ca2+介导的激酶信号通路、膜运输和细胞骨架重塑、ROS稳态、胁迫与防御、光合作用、基因表达和蛋白质周转、糖代谢、氨基酸代谢等途径在星星草应答氧化胁迫过程中发挥了重要作用。同时,我们利用分子遗传学方法解析了质外体定位的星星草类萌发素蛋白(PutGLP)在根中优势表达,并受到NaCl、NaHCO3和CdC12胁迫的诱导。PutGLP具有超氧化物歧化酶和草酸氧化酶活性,对维持ROS稳态(O2·-和H2O2)有重要作用。在野生型拟南芥中过量表达PutGLP可以增强根系对盐碱胁迫的抗性。此外,对星星草谷氧还蛋白(PutGrxS10)家族的分析表明;PutGrxS10属于Grx家族第Ⅰ类中的GrxC5/S12亚家族,具有GrxS12亚家族的保守活性基序“WCSYS”。原核表达获得的PutGrxS10蛋白的氧化还原状态受β-巯基乙醇和DTT等还原剂调控。氧化还原蛋白质组学的结果表明,PutGrxS10保守基序中Cys78的氧化水平在氧化胁迫时显著上升,这暗示着Cys78的氧化还原变化可能参与其酶活性调控。我们同时发现PutGrxS10基因在星星草根、茎、叶、花、鞘、穗和种子中均有表达,并且在星星草应答H2O2、NaHCO3和Na2CO3等胁迫时表达量上升。这表明星星草可通过调节PutGrxS10的转录与翻译后修饰参与氧化胁迫应答过程的ROS稳态调节。整合生理学、氧化还原蛋白质组学与分子遗传学的研究结果,我们推测星星草利用多种策略应答氧化胁迫,主要包括:(1)通过调节重要蛋白质的氧化还原与可逆磷酸化水平调控Ca2+介导的信号转导途径,从而调节下游氧化胁迫应答基因的表达;(2)通过蛋白质氧化还原水平的变化调控膜泡运输、蛋白质跨膜转运、脂质运输,以及小分子物质(水分、离子和代谢产物)转运等过程;(3)调节细胞骨架蛋白质丰度引发细胞骨架的动态重塑;(4)改变重要抗氧化酶的丰度和氧化还原状态调节其酶活性,维持细胞内的ROS稳态;(5)调控病程相关蛋白的丰度和氧化还原水平应答氧化胁迫;(6)调控参与光合电子传递、ATP生成和碳同化的蛋白质丰度和氧化还原水平,调节光合效率;(7)增加转录和蛋白质合成相关蛋白质的丰度诱导下游应答基因的表达;增加分子伴侣的丰度避免蛋白质氧化损伤;增加蛋白质降解相关蛋白质的丰度降解氧化损伤蛋白质从而降低其细胞毒性;(8)调控糖代谢、氨基酸代谢,以及四吡咯化合物合成等过程重要酶的丰度与氧化还原状态,应答氧化胁迫。这些结果为深入研究植物盐碱胁迫应答的氧化还原调控网络提供了新的线索,也为耐盐农作物的选育提供了重要信息。


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