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盐芥AQPs基因家族分析及EsPIP1;2和EsPIP2;1抗逆功能研究

钱卫国  
【摘要】:盐芥是十字花科盐生植物,与拟南芥的亲缘关系十分接近。盐芥具有个体较小、生命周期较短、自花授粉、种子数目多和基因组较小等特点,且具有极强耐旱、耐盐和耐低温等特性,近年来成为研究植物抗逆机制的模式植物。从盐芥中挖掘抗逆相关基因对提高植物在逆境中的适应性有重要意义。以往的研究表明,植物水通道蛋白(aquaporins,AQPs)在响应非生物胁迫中起重要作用。AQPs是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白通道,属主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIPs)家族成员,几乎存在于所有生物中。除水分子外,还可以跨膜转运其他小分子。许多高等植物中AQPs家族相继被报道,而盐芥AQPs的研究尚处于起步阶段。本研究利用盐芥基因组数据库,结合生物信息学对盐芥AQPs全基因组特征进行分析,根据基因表达结果选取EsPIP1;2和EsPIP2;1基因,对这两个基因的蛋白特性、亚细胞定位、转水活性以及抗逆功能进行了分析,为盐芥AQPs基因家族研究奠定了一定的理论基础。主要研究结果如下:(1)以MIP的序列号PF00230为基础,利用HMM软件在盐芥Phytozyme数据库中检索,并结合在NCBI中以拟南芥AQPs序列比对盐芥基因组的结果,检索得到盐芥中共有35个AQPs。进化树分析表明盐芥AQPs可分为4个亚族,即质膜内在蛋白(PIPs,12个)、液泡膜蛋白(TIPs,11个)、类根瘤菌26蛋白(NIPs,9个)和小碱基内在蛋白(SIPs,3个)。除EsTIP2;2以外,其余AQPs基因随机分布在盐芥的7条染色体上。所有EsAQPs都具有2个完整的NPA保守基序和6个跨膜结构域,基因结构、保守结构域和特征位点分析表明,EsAQPs具有结构多样性和亚家族特异性。(2)对根、茎、叶、花和角果组织中EsAQPs基因的表达水平进行分析,结果表明,所有组织中均能检测到35个EsAQPs的表达,其中所有EsPIPs以及EsTIP1;2、EsTIP2;1、EsNIP1;2、EsNIP5;1、EsSIP1;1和EsSIP2;1在所有组织中的转录水平都很高,表明这些基因在盐芥生长发育过程中十分重要。另外,我们发现EsTIP3;1和EsTIP3;2在角果中特异性高表达,这表明EsTIPs在种子发育和成熟过程可能也扮演着重要的角色。(3)非生物胁迫下(盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫)EsAQPs的定量结果显示,多数的EsAQPs都响应各种非生物胁迫。多数的EsAQPs在不同非生物胁迫中的表达模式为胁迫初期上调表达,而后随胁迫时间增加表达量逐渐下降,但后期表达量恢复到对照水平或高于对照。既在不同非生物胁迫下显著差异性表达又在不同组织中高表达的EsAQPs 有 EsPIP1;2、EsPIP1;3、EsPIP2;1、EsPIP2;7、EsTIP1;2 和 EsTIP2;1。这些结果表明,EsAQPs基因可能在盐芥胁迫应答过程中发挥着重要作用。(4)盐芥水通道蛋白EsPIP1;2和EsPIP2;1为典型的PIPs,分别与拟南芥AtPIP1;2和AtPIP2;1亲缘关系最为接近。利用洋葱表皮和拟南芥原生质体瞬时表达系统验证EsPIP1;2和EsPIP2;1的亚细胞定位,结果显示两者都定位在质膜上。通过非洲爪蟾卵母细胞表达系统发现EsPIP1;2和EsPIP2;1都具有转水功能,其中EsPIP2;1的转水效率大于EsPIP1;2。另外,EsPIP1;2和EsPIP2;1共表达可进一步增强转水活性。(5)对比过表达EsPIP1;2的转基因和野生型拟南芥在盐和干旱胁迫下的生长情况,结果显示异源表达EsPIP1;2能显著增强转基因拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受能力。在胁迫条件下,转基因拟南芥的种子萌发和根部延长明显优于野生型。盐胁迫下,转基因株系具有较低的H2O2、丙二醛(ma1ondia1dehyde,MDA)含量和离子渗漏(ion 1eakage,IL)及较高的K+/Na+比;干旱胁迫下,转基因株系的脯氨酸含量和抗氧化酶(CAT、POD和SOD)活性显著高于野生型,H202、MDA含量和IL显著低于野生型。这些结果表明,过表达EsPIP1;2能够减少转基因拟南芥的脂质过氧化和膜损伤,从而提高了转基因拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性。另外,过表达EsPIP1;2能够提高抗氧化酶活性和促进渗透调节来增强转基因拟南芥对干旱胁迫的抗性,平衡K+/Na+比来增强转基因拟南芥对盐胁迫的抗性。(6)EsPIP2;1转基因拟南芥的表型分析结果表明,过表达EsPIP2;1能够增强转基因拟南芥对盐和干旱的耐受能力。盐胁迫下,转基因株系拥有更低的H2O2、MDA、IL,更高的叶绿素含量、Fv/Fm和NPQ以及更高的盐胁迫相关基因的表达量,表明过表达EsPIP2;1的转基因拟南芥能够促进胁迫相关基因的表达,减少ROS的产生和膜损伤程度以及维持更高的光合速率,从而提高了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。干旱胁迫下,转基因株系拥有更高的抗氧化酶活性、脯氨酸含量和相对含水量,更低的H2O2、MDA和IL以及水分流失率,表明过表达EsPIP2;1能够提高转基因拟南芥抗氧化酶活性、促进渗透调节和维持水分含量,减少脂质过氧化和膜损伤,从而提高了转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性。另外,ABA处理下,转基因拟南芥的萌发率和根长以及气孔开度都显著高于野生型。本研究提供了盐芥AQPs家族信息,并初步揭示了 EsPIP1;2和EsPIP2;1在植物抗逆中的作用,为进一步挖掘AQPs调控抗逆性的分子机制提供了理论基础。


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