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东北红豆杉中紫杉烷对UV-B辐射的响应规律及其代谢调控分子机制解析

寇萍  
【摘要】:东北红豆杉(Taxus cuspidata)中所含有的紫杉醇是世界公认的具有极高药用价值的二萜类化合物,由于其独特的抗癌机制已作为广谱抗癌特效药用于各类癌症的临床治疗,医药市场需求量巨大。受限于紫杉醇的其他来源和生产方式存在技术瓶颈,难以大规模应用,所以目前紫杉醇的供应仍然直接或间接的来源于红豆杉自然资源,其他紫杉烷类成分则可作为紫杉醇生物合成的前体物质及其半合成的原料,然而东北红豆杉植株生长缓慢且紫杉烷含量极低,且因人类过量砍伐而濒临灭绝。已有研究表明,紫杉醇的生物合成途径会受到多种生理生态因子的影响和调控,而UV-B作为一种重要的光生态因子,应用于药用植物次生代谢过程调控和活性成分诱导增量的研究已成为相关领域的研究热点。本文在建立了准确可靠的次生代谢物质量控制分析方法的基础上,探究了UV-B诱导对东北红豆杉叶片中紫杉烷类成分含量的影响规律,并结合生理生化指标及转录组测序分析初步探讨了诱导调控机制,之后对UV-B诱导下东北红豆杉中紫杉醇合成代谢通路的关键酶候选基因及调控因子进行了挖掘和表达验证,本研究的主要内容及结果如下:1、建立了红豆杉中靶向代谢物的UPLC-MS/MS质量控制分析方法,同时针对性的检测红豆杉针叶中14种主要紫杉烷及黄酮类成分(10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、7-表紫杉醇、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇、槲皮苷、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、白果素、银杏双黄酮、金松双黄酮)。方法学验证表明各目标成分在检测范围内均呈现良好线性关系,并且该分析方法的灵敏度、精密度、重现性、准确性均较好。此外优化建立了基于高速匀质结合超声辅助提取法的红豆杉叶片样品制备工艺,为后续样品中目标活性成分的高通量准确检测分析提供了必要的技术基础。该质量控制分析方法用于三种红豆杉叶片样品的检测分析可达到预期定性定量的效果,可满足红豆杉中含量低且结构相似的靶向代谢物高通量检测分析的需要,为质量控制及后续相关研究提供了必要的检测手段与技术支持。2、探究了东北红豆杉针叶紫杉烷及黄酮成分对UV-B的代谢响应规律,首先通过使用不同强度的UV-B辐射处理东北红豆杉幼苗,并对辐射诱导后东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类化合物含量进行了 0至96 h的动态监测,以初步探究东北红豆杉针叶中紫杉烷和黄酮类成分对UV-B的次生代谢响应规律,结果发现东北红豆杉经UV-B辐射后针叶中主要紫杉烷类成分积累量普遍升高后降低,且辐射强度越大诱导增量效果越显著,各紫杉烷类成分含量主要是在48 h或72 h时达到最大值且各紫杉烷类成分之间普遍表现出显著的正相关性。此外UV-B辐射后针叶中主要黄酮类成分大多显著升高后降低,且胁迫强度越大诱导效果越显著,大部分黄酮类成分主要集中在48 h达到最大值。由UV-B诱导引起的次生代谢响应中黄酮类成分比紫杉烷类成分反应更敏感、更迅速,黄酮类成分的最大增量达到了紫杉烷类最大增量的1.81-3.21倍,且紫杉烷类和黄酮类成分含量之间呈现出显著的正相关性,表明东北红豆杉在自我防御时紫杉烷和黄酮类成分的生物合成过程很可能具有一定的协同作用。可为东北红豆杉的UV-B定向高效培育、紫杉烷类成分在基因水平的合成调控机制解析及高效利用东北红豆杉可再生的针叶资源提供重要数据参考和理论依据。3、为探究东北红豆杉针叶在生理生化层面对UV-B辐射的响应及调控规律,使用不同UV-B辐射时间诱导东北红豆杉幼苗。发现UV-B辐射会降低东北红豆杉叶片的生物量和相对含水量,辐射强度越大越不利于叶片生物量的积累且对细胞水分生理的影响越显著;UV-B辐射会引起东北红豆杉叶片气体交换参数的显著降低,在高强度辐射下净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率下降了 56.53%-77.68%;东北红豆杉叶片在UV-B诱导下叶绿素和类胡萝卜素含量大体呈现上升后下降的趋势;东北红豆杉会激活抗氧化酶系统以响应和防御UV-B辐射,SOD、CAT、POD酶活性在UV-B诱导前期呈显著上升趋势,之后随着辐射时间的增加而下降,且辐射强度越大对酶活的影响越大;丙二醛含量会随着UV-B处理时间的延长而逐渐显著升高,细胞膜逐渐受损。相关性和聚类分析表明UV-B辐射时气体交换参数和光合色素之间呈显著正相关性(p0.05),但与丙二醛含量之间存在极显著负相关关系(p0.01),抗氧化酶SOD、CAT和POD之间关系密切,可为UV-B对植物的调控作用研究、东北红豆杉的UV-B定向优质培育及可再生的针叶资源高效利用提供理论依据和重要的指导意义。4、通过DNBSEQ测序技术获得了 UV-B诱导前后的东北红豆杉针叶的转录组信息,经过组装后共获得102301个unigene,平均长度为1284 bp。挖掘筛选出UV-B诱导前后东北红豆杉针叶中的差异表达基因共5949个,其中上调表达4016个基因,下调表达1933个基因,可发现UV-B诱导后的上调表达基因数显著高于下调表达基因数。共鉴定注释到了 2119个unigene分布于57个转录因子家族,主要集中于MYB、AP2-EREBP、C3H、bHLH、Trihelix、mTERF、WRKY 和 NAC 家族。在 GO 分类富集功能分析重点关注的生物过程方面,差异基因主要集中于细胞过程、代谢过程、应激反应、生物调节和生物过程调节。共有3141个差异表达基因经过KEGG分析主要归类到18个KEGG pathway类型,其中注释数目最多的为代谢通路。此外,紫杉醇萜类骨架生物合成通路基因受到UV-B诱导后有12个关键酶基因的表达量产生显著差异,其中1 1个MEP途径的关键酶基因均发生了上调表达,1个MVA途径的甲羟戊酸磷酸激酶基因受到混合模式调节,表明东北红豆杉紫杉醇生物合成上游通路关键酶基因受到UV-B的显著诱导与调控且转录水平都有显著提高。5、对UV-B调控东北红豆杉中紫杉醇合成通路的分子机制进行了解析,共挖掘筛选出17个紫杉醇生物合成关键酶基因,24个差异表达且序列完整的候选WRKY蛋白序列。对鉴定获得的24个TcWRKY转录因子进行生物信息学分析,保守结构域分析结果表明共分为三个大类:Ⅰ组5个成员;Ⅱ组18个成员,其中Ⅱ亚组4个成员,Ⅱb和He亚组分别4个和2个成员,Ⅱ亚组8个成员;Ⅲ组只有一个成员。保守基序和进化树分析共鉴定出5个保守基序且每个蛋白的基序种类和数量差异很可能与家族成员的特定功能有关,这些TcWRKY蛋白在生物进化过程中比较保守。采用qRT-PCR方法分析东北红豆杉中紫杉醇生物合成关键酶基因的表达模式,结果表明萜类骨架MEP途径的6个关键酶基因表达水平均受到了 UV-B的正向调控,其中TcDXS、TcMCS和TcHDS基因对UV-B的响应更敏感。筛选所得11个紫杉醇生物合成关键酶基因表达量随着UV-B处理时间的增加普遍呈现升高后递减规律,其中TcT13H、TcTBT、TcPAM和TcDBTNBT基因在48 h时对UV-B诱导的响应最敏感。对UV-B诱导下差异表达最显著的12个TcWRKY转录因子基因的转录表达水平进行了测定,发现UV-B会诱导东北红豆杉中TcWRKY基因表达水平的显著上调,但各基因具体的表达模式存在差异。TcWRKY1、TcWRKY4、TcWRKY11、TcWRKY12基因很可能在48 h对UV-B诱导的敏感性显著增强,并主要集中在诱导中后期响应UV-B来调控东北红豆杉中相关的防御过程。TcWRKY10、TcWRKY16、TcWRKY17基因可能在48 h时开始显著发挥各自的生物学功能以增强东北红豆杉的应激防御过程。本研究建立的高效准确的红豆杉针叶中紫杉醇等目标活性成分质量控制分析方法可为红豆杉中次生代谢产物相关研究提供科学基础和技术参考,系统性的研究了东北红豆杉的次生代谢产物含量、生理生态指标、次生代谢通路关键酶基因对UV-B辐射的响应规律,并基于转录组信息筛选分析紫杉醇合成通路酶基因和转录因子的表达模式,为后续东北红豆杉的UV-B定向优质培育体系的建立、紫杉醇的生物合成途径及调控机制的解析、以及红豆杉可再生的针叶资源的开发利用提供重要数据参考和理论依据。


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