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白桦成花计时基因的研究

魏志刚  
【摘要】: 实验旨在利用RT-PCR技术克隆白桦(Betula platyphalla)的成花计时相关基因,从而为揭示强化条件下白桦提早开花结实的基因调控机理奠定基础。 实验探讨了克隆成花计时基因最佳的取材时间是,每年的5月末到6月初,顶端分生组织向花原基转变时的一个星期内集中进行,具体时间随每年温度变化做适当调整。 克服了常规方法和试剂盒无法提取出富含酚类化合物、多糖和一些尚无法确定的次级代谢产物的白桦花芽组织RNA的障碍,提出了3种白桦雄花芽组织RNA的提取方法:CTAB、CTAB-DNA酶消化法和SDS-DNA酶消化法。对这3种方法比较后,确定本实验采用CTAB-DNA酶消化法和SDS-DNA酶消化法提取白桦雄花芽组织的总RNA。 建立白桦花芽组织RNA的逆转录体系。通过优化扩增体系和扩增程序后,初步建立了克隆白桦成花计时基因的RT-PCR技术体系。 利用生物信息学的技术和相关软件,共设计出7对克隆白桦成花计时基因的简并引物。经过筛选,1号简并引物较合适(PS 5’—ARAARGCNCAYGARAT,PA 5’—RCATCCANGGNGGCAT)。 对1号简并引物扩增出的3条特异性条带进行了回收、克隆和测序;与国际核苷酸数据库进行了同源性比较,对特异性片段的功能进行初步的分析和确定。结果发现分子量最大的片段(长675bp)与成花计时基因同源性较低,而与植物发育过程中的果胶酶基因具有80%同源性,而且局部片段对比分值达184;通过蛋白质三维结构预测发现,它具有明显的功能结构域。据此,可初步确定此片段是白桦果胶酶基因的部分片段。其它两条片段测序时出现信号重叠,需做进一步分析和研究。


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