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抗冻蛋白基因对山杨等植物遗传转化的研究

李春霞  
【摘要】: 克隆得到抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)基因,并通过农杆菌介导法将它导入杨树,培育抗寒冻的杨树新品种是本研究的主要目的。研究内容如下: 首先利用RT—PCR方法从胡萝卜中克隆到抗冻蛋白基因,并构建了植物表达载体PBI—AFP,采用电转化法将PBI—AFP质粒转入根癌农杆菌EHA105中,构建了双元转化载体。经生根筛选及PCR检测,证明胡萝卜AFP基因已整合入烟草基因组。该工作证明了构建的载体是正确的并在植物中是有效表达的,这为培育高度抗寒耐寒作物、树木新品种提供基础,也为进一步研究抗冻蛋白基因的表达及其功能奠定了基础。 本实验建立了山杨(Populus. davidiana Dode)叶片高效再生系统,选择激素浓度、基础培养基、琼脂浓度、蔗糖浓度等因素进行比较,实验表明:WP+6—BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+0.8%琼脂+2.0%蔗糖为最佳诱导山杨叶片不定芽分化的培养基,分化率达95%以上。通过卡那霉素敏感性实验,确定山杨叶片分化与根系对卡那霉素的忍耐极限分别为50mg/L,15mg/L。 在建立山杨叶片高频再生系统的基础上,利用农杆菌介导叶盘法开展了AFP基因转化杨树的研究。确立了山杨叶片高效的遗传转化体系:将山杨叶片剪成1.0cm×0.5cm大小,预培养2—3d;菌液浓度为OD_(600)=0.4—0.5;侵染时间为8—10min;共培养3d。经过叶盘不定芽诱导的卡那霉素60mg/L、80mg/L 90天连续筛选,获得4株卡那霉素抗性植株,其中一株,经PCR检测为阳性,初步证明AFP基因已转入山杨中。


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