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芜菁花青素合成过程中相关基因的筛选及表达研究

许志茹  
【摘要】:以光敏感型不同的‘津田’和‘赤丸’两个芜菁品种为试材,构建了两个cDNA文库,对试材进行遮光处理和光照处理后构建了四个消减文库(1,津田光处理红色块根皮-津田暗处理白色块根皮;2,津田暗处理白色块根皮-赤丸光处理红色块根皮;3,津田暗处理白色块根皮-津田光处理红色块根皮;4,赤丸光处理和暗处理红色块根皮-津田暗处理白色块根皮)。从cDNA文库和消减文库中筛选特异基因片段并进行初步的生物信息学分析。同时将筛选到的特异基因片段体外扩增后点到玻片上构建cDNA微阵列。从不同光照处理的津田芜菁和赤丸芜菁试材中提取mRNA样品,在反转录过程中利用荧光标记物cy3和cy5标记cDNA,随后与芯片杂交以检测不同处理条件下津田芜菁和赤丸芜菁中基因群体的表达变化,从而筛选花青素生物合成过程中相关的结构基因群体和调节基因群体。利用紫外-可见分光光度计检测了津田芜菁和赤丸芜菁块根皮中花青素的积累与光照时间的相关关系。通过Northern杂交技术分别检测了遮光处理、日光处理、恒定光处理和UV-A处理条件下‘津田’和‘赤丸’芜菁块根皮中PAL、F3H、DFR、ANS和MYB等与花青素合成相关基因表达量的变化。主要研究结果如下: 1.从cDNA文库中筛选到618个特异基因片段。从消减文库中筛选出1424个特异基因片段,其中包括花色素生物合成途径所需酶的结构基因:PAL,CHS,F3H,DFR,ANS,同时也筛选到花色素生物合成相关的调控因子的编码序列,如bHLH,WD40,MYB和bZIP。将特异基因片段的PCR产物纯化后点到玻片上,成功地构建了cDNA微阵列。 2.将消减文库中的1424个特异基因片段填写到KEGG数据库的代谢途径中,从库1和库4中筛选到PAL,CHS,DFR和ANS等与花青素生物合成相关的基因片段,与预测的相同,这些基因参与津田芜菁和赤丸芜菁的花青素生物合成。比较反向构建的消减文库1和3发现,在消减文库1中筛选到的基因片段涉及54条代谢途径,其中包括类黄酮生物合成等特异的代谢途径。在消减文库4中筛选到的基因片段涉及48条代谢途径也包括类黄酮生物合成和生物碱生物合成的代谢途径。在库2中筛选到CHS、bHLH和bZIP的基因片段。 3.cDNA文库制备的芯片杂交结果显示,津田芜菁光下表达的基因数量多于黑暗条件下表达的基因,赤丸芜菁黑暗条件下表达的基因数量多于津田芜菁黑暗条件下表达的基因。某些基因的功能需要进一步验证。 4.消减文库制备的芯片杂交结果显示,UV-A处理和日光处理条件下,津田芜菁中表达的基因明显多于黑暗条件下表达的基因,同时有大量的与花青素生物合成相关的基因表达,由此证明UV-A处理和日光处理都可以使津田芜菁块根皮着色。 5.光敏感型津田芜菁块根皮中花青素含量与光照时间呈正相关关系;赤丸芜菁块根皮中花青素的积累与光照时间没有明显的相关关系。 6.Northern杂交结果表明:在津田芜菁中,恒定光和UV-A都可以诱导PAL、


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