天花粉蛋白基因表达载体的构建及转化杨树的研究

【摘要】：杨树在我国分布广泛,种类繁多,繁殖容易,栽培简便,适应性强,生长速度快,材质优良,是用材、防风、绿化的主要造林树种。但杨树的病虫害种类繁多,危害严重,加之长期使用有机化学农药,更给我国的林业生产和生态建设造成了巨大的经济损失。所以,杨树病虫害防治是目前林业生产亟待解决的问题,也是林木遗传育种工作者的首要任务。 天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是从葫芦科药用植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)块根中分离得到的单链核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP),能够抗烟草花叶病毒等7种病毒、稻瘟病菌等9种病原真菌及蚜虫等4类害虫。利用基因工程手段,将具有抗病和抗虫特性的天花粉蛋白基因转入杨树,增强杨树抗逆性,使杨树免遭病虫危害,具有无污染,不杀伤天敌,保护生物多样性,维持生态平衡等特点,且意义重大。 本研究构建了含有TCS启动子及结构基因的植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS和pC-tPro-TCS,及受PAL(Phenylalanine Ammonia-Lyase)诱导型启动子调控的植物表达载体pC-pPro-2-TCS、pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS。pC-tPro-TCS-GUS是在pCambia1381表达载体的GUS报告基因上游嵌合入TCS启动子及结构基因而成。pC-tPro-TCS是在pCambia1301多克隆位点中插入TCS启动子及结构基因,该基因下游不具有GUS报告基因。pC-pPro-2-TCS是在pPPG表达载体的PAL诱导型启动子下游嵌合入TCS基因,TCS基因在串联启动子PAL控制下;在天花粉蛋白基因的起始密码子ATG前12bp处有原载体中的起始密码子ATG,表达后形成了4个融合的氨基酸位于重组天花粉蛋白的N端;TCS基因下游为转录终止信号。pC-pPro-1-TCS和pC-pPro-1-TCS-GUS是将TCS基因插入到pPPG表达载体的PAL启动子的非翻译区与GUS报告基因上游,TCS基因在串联启动子PAL控制下;天花粉蛋白基因的起始密码子与原载体中的起始密码子是同一ATG,在重组天花粉蛋白的N端不会形成融合的氨基酸。在表达载体pC-pPro-1-TCS-GUS中,TCS基因下游没有转录终止信号,具有GUS报告基因;在表达载体pC-pPro-1-TCS中,TCS基因下游有转录终止信号。 将构建好的植物表达载体转化农杆菌LBA4404,提质粒进行特异引物PCR扩增。PCR扩增结果验证了植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS、pC-tPro-TCS、pC-pPro-2-TCS、pC-pPro-1-TCS-GUS和pC-pPro-1-TCS都已转入进农杆菌中。以小黑杨(Populus simonii×P.nigra)为材料,采用农杆菌介导法首次将天花粉蛋白基因(TCS)导入杨树,为进一步探讨TCS对杨树病虫害的广谱抗性提供了材料,也为获得更多抗病虫转基因树木奠定了理论基础。