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白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆

魏继承  
【摘要】:白桦(Betula platyphylla)为我国东北与内蒙古地区的先锋树种,广泛用于建筑、家俱和造纸业。为缩短白桦育种周期,加速其育种进程,近些年来人们在白桦早花诱导方面取得了巨大成功。然而白桦花期基因表达背景却鲜为人知,直到最近几年,若干花发育相关基因在欧洲白桦中才得以成功克隆。为进一步充实本领域研究,继本实验室白桦生殖生物学雄厚的研究基础,本文从事了以下工作。 对白桦花序进行分期取材,基于SMART(Switching Mechanism At 5'end of RNATranscript)策略,利用PCR—Select~(TM) cDNA Subtraction Kit分别构建白桦雌雄花序抑制性消减文库。经多重比对分析,计算文库冗余度,雌花正向库为12.14%,雌花反向库为15.48%,雄花正向库为29.30%,雄花反向库为27.85%。去除重复EST后,设定期望阈值为e~(-10),经blastX分析,去除rDNA污染和镶嵌克隆,雌花正向库,共容纳EST数为65条:雌花反向库中为71条:雄花正向库中为68条;雄花反向库中为65条。进一步合并后,雌花消减库共获得126条EST,雄花消减库共获得115条EST。文库中存在一些同类EST,分析表明,它们对应着同一基因的不同片段,或是代表同一基因家族的不同成员。雌、雄花消减库比较表明,两者少有冗余现象。按GO分类系统,消减库中EST参与新陈代谢、细胞生长与分裂、细胞结构组成、跨膜运输、信号传递、胁迫应答、转录调控、翻译、蛋白降解等生命过程。由于文库构建是以总RNA为起始材料,测序结果中有一定程度的rDNA污染。Blast比对结果表明,文库中容纳了一些明显同花发育相关的EST,它们将成为进一步研究白桦花发育问题的物质基础。 根据公共数据库中欧洲白桦已发表序列,通过RT-PCR手段,克隆了四个花发育相关基因BpMADS1、3、5及BpSPL1,序列分析表明两种白桦在核酸及蛋白序列上存在一定差异,其中三个基因的EST未出现在消减文库中,对此种现象出现的原因作了推测;以消减文库中的两条EST为材料,通过RACE手段克隆了两个新的花发育相关基因—BPSPL2和BPAGL2,使用TreeTOP工具对其系统发生位置进行了初步评价。 以消减文库中的四个花发育相关基因的EST为材料,建立了外标实时定量PCR体系。研究结果表明,几个目标基因均呈现时序表达特点,根据目的基因的表达模式对其可能参与的功能作了初步分析。


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