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小菊锌指蛋白基因的表达分析及耐盐差异蛋白的分离鉴定

赵飞  
【摘要】: 小菊(Chrysanthemum morifolium)是园林景观植物配置中常用的宿根花卉之一。花量繁多,花色丰富,观赏价值较高。本研究在对大量小菊资源进行抗盐碱筛选的基础上,对其中抗逆性强的品种进行了深入的研究,从中分离获得了盐碱相关差异蛋白,并获得了一个新的锌指蛋白基因克隆,经结构分析、同源性分析以及转化烟草体系等实验研究,证明其与植物耐盐性密切相关。课题研究获得的小菊品种或品系资源在盐渍坏境下具有广阔的应用前景,同时所获得的小菊锌指基因资源在抗性品种选育研究中具有较高的利用价值。 课题研究结果如下: (1)为筛选出耐盐的小菊资源类型,本研究分别利用25 mmol/LNa_2CO_3、NaHCO_3以及二者的复盐对99个小菊资源进行了耐盐碱筛选,获得抗性资源24个;通过50 mmol/LNa_2CO_3处理,最终从初选的小菊中筛选出耐Na_2CO_3的小菊资源8个:‘阳光’、东林13、‘富丽’、‘雪涛’、‘金不换’、D4~(1-1)、东林9、D.pacificum。 (2)在50 mmol/L的Na_2CO_3胁迫下,对筛选出的5个耐盐小菊及5个盐敏感型小菊进行了抗盐生理指标的分析比较,研究发现:①耐盐小菊的脯氨酸含量以及SOD、POD活性水平均相对高于盐敏感型品系,而MDA含量则相对较低;②对耐盐小菊品系来说,在不同抗性生理指标上的表现不一致。Na_2CO_3胁迫下‘雪涛’脯氨酸合成剧增,而SOD活性增强不显著;东林13则与之相反。小菊‘阳光’的脯氨酸合成及SOD活性均极显著高于对照。 (3)锌指蛋白基因是近年来在植物抗旱、耐盐研究中起重要作用的一类转录因子。本研究利用半定量RT-PCR技术对锌指蛋白基因在不同耐盐小菊株系中的表达进行了研究。研究发现,在50 mmol/LNa_2CO_3胁迫下,耐盐小菊‘阳光’锌指蛋白基因表达量明显增强,而盐敏感型小菊‘神韵’表达量极其微弱。 (4)本研究利用RT-PCR从耐盐小菊‘阳光’cDNA中克隆得到一个新的锌指蛋白基因,命名为CmSTZF(Chrysanthemum morifolium stress-tolerance zinc finger)(GenBankaccession no.DQ864730)。序列分析表明其在111~151氨基酸序列间存在一与An1 C端同源的锌指结构域,属AN1型锌指,其锌指保守序列为C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C,序列全长794bp,编码170个氨基酸,蛋白分子量大小为18.1 KDa。该锌指蛋白与多种植物逆境相关蛋白具有同源性。三维结构模拟显示该锌指保守结构域与水稻耐盐锌指蛋白OSISAP1结构域空间结构一致。 (5)分别构建了CmSTZF与OSISAP1的融合表达载体pET14b/His-CmSTZF以及pET14b/His-OSISAP1,通过IPTG诱导进行了蛋白的完整表达。结果显示,所获得的小菊CmSTZF与来源于水稻的OSISAP1锌指融合表达蛋白分子量近似,约为23 KDa,表明克隆得到的小菊锌指蛋白基因CmSTZF可以完整表达。 (6)本研究利用二维液相色谱技术,对150 mmol/L Na_2CO_3胁迫下提取的耐盐小菊‘阳光’叶片及对照样品的总蛋白进行了分离分析,并利用ProteoVue软件对分离组分进行转换,共获得差异蛋白点33个,其中显著增强表达的蛋白差异点(R/L值大于2)11个。选择其中差异最为明显的蛋白细.分中的6个色谱峰对应组分进行质谱分析,鉴定分析结果发现,其中含有目前已经鉴定出的与盐碱相关的蛋白质:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、细胞色素P450、钙离子结合蛋白、Zn/Cu SOD、谷胱甘肽硫转移酶、Na~+/H~+反转运蛋白。 (7)利用所获得的CmSTZF锌指克隆,借助Gateway技术成功构建了小菊锌指蛋白基因CmSTZF的表达载体pH7WG2D-CmSTZF。并通过电转导入农杆菌菌株LBA4404,建立了农杆菌介导的烟草遗传转化体系,经PCR、PCR-Southern鉴定获得转CmSTZF的转基因烟草株系2株。在Na_2CO_3胁迫下转基因株系与对照相比表现出明显的抗逆性,可见所获得的小菊锌指蛋白基因与植物的抗盐性密切相关。


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