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马鹿精子膜蛋白纯化与理化性质分析

徐境羚  
【摘要】: 成熟精子的膜表面含有多种蛋白质,有些是精子本身固有的,有些是在精子成熟过程中粘附到精子表面的。精子表面的膜蛋白是精子发生成熟过程中的重要标志分子,与受精和胚胎的早期发育关系密切,随着生命科学的发展,人们发现精子膜蛋白不仅具有抗原性,而且它们在维持精子形态结构完整、完成精子的新陈代谢和生殖功能中发挥着重要的作用,特别是与精卵识别、精卵结合以及质膜融合等受精活动密切相关。其中部分抗原可诱导机体产生相应的自身抗体,进而影响精子的受精能力,导致免疫性不育。 本文以我国重要的经济动物—马鹿的精子作为实验材料,进行了精子膜蛋白的提取、分离纯化,同时对其理化性质加以分析,并以纯化的马鹿精子膜蛋白作为抗原,制备了多克隆抗血清。利用抗血清进行了精子膜蛋白的定位、对精子运动的影响等的研究,现将研究结果简述如下: 1、马鹿精子膜蛋白的分离纯化及鉴定 采用非离子型去污剂裂解法提取马鹿精子膜蛋白,根据Western-blot和SDS-PAGE电泳实验结果,确定分离纯化的条件。SDS-PAGE电泳结果显示,共有8种马鹿精子膜蛋白被提取出来,其中,有4条膜蛋白带非常清晰。采用胶上纯化法,即利用SDS-PAGE电泳,0.3MKCl进行凝胶染色和反复冻融及高速离心等技术从马鹿精子膜蛋白溶液中分离纯化了该4种膜蛋白,其分子量分别为:98.4kDa,67.6kDa,47.3kDa,29.1kDa。在SDS-PAGE电泳图谱中,纯化的马鹿精子膜蛋白在还原和非还原条件下均为单一条带,无链间二硫键。说明采用上述方法纯化的马鹿精子膜蛋白为单一组分。 糖蛋白的检测中发现,在图谱中有3条很清晰的糖蛋白带,与纯化出来的前3种马鹿精子膜蛋白带吻合,确定为糖蛋白。采用BCA试剂盒对提取的马鹿精子膜总蛋白及纯化的单一马鹿精子膜蛋白进行分析,测得其含量分别为468.12μg/ml,95.67μg/ml,184.23μg/ml,47.68μg/ml,58.32μg/ml。 2、马鹿精子膜蛋白的双向电泳实验 由双向电泳图谱发现,发现马鹿精子膜蛋白有823个蛋白质点;其分子量分布在10kDa—100kDa之间,等电点PI在4-7(pH)之间。 3、马鹿精子膜蛋白多克隆抗血清的制备 用纯化的马鹿精子膜蛋白免疫雄性BALB/C小鼠,制备多克隆抗体。通过ELISA法测得抗血清的效价为1-2×10~3。Western-blot结果表明,纯化的马鹿精子膜蛋白具有免疫反应性,为特异性抗原。 4、抗血清对精子运动的影响 在体外实验中,发现抗马鹿精子膜蛋白抗血清对马鹿精子的直线运动无显著影响;同时还发现抗血清对小鼠精子的直线运动也无明显影响;但对获能的马鹿精子的直线运动却表现为较为显著的影响,并表现为剂量依赖性。 5、马鹿精子膜蛋白在精子上的定位及保守性 通过对马鹿精子和小鼠精子进行免疫细胞化学程序染色并结合激光共聚焦显微镜检测,结果表明,纯化的精子膜蛋白大部分都存在于马鹿精子的顶体区域;而对小鼠精子的定位研究中,也发现膜蛋白存在于顶体区。 6、马鹿精子膜蛋白多抗血清的特异性 通过对马鹿精子膜蛋白的琼脂双向免疫扩散实验,发现马鹿精子膜蛋具有组织特异性。与小鼠的附睾、精巢、输精管有免疫交叉反应,但与重要脏器心、肝、脾、肾无免疫交叉反应。说明马鹿精子膜蛋白具有组织特异性。


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