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EST技术分析西伯利亚蓼耐盐机制及耐盐相关基因克隆

刘关君  
【摘要】: 西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm)为多年生草本植物,可在盐碱地碱斑上生长,为盐碱地的优势种,是研究植物耐盐碱胁迫的优良材料。在以往对西伯利亚蓼的研究基础上,本文从以下几个方面进行研究: 1.通过对西伯利亚蓼NaHCO_3混合cDNA文库2575个EST的分析,拼接出1977个TUTs,其中包含206个重叠群(contig)和1771个单拷贝EST(singleton)。确定了高丰度表达、中丰度表达EST和低丰度表达EST;高丰度表达基因51个,占所有TUT的2.6%,代表457个EST,占总EST的17.77%,其中参与光合作用的EST占高丰度表达基因的54.92%。表明NaHCO_3胁迫条件下叶部的主要生理功能仍为光合作用;中丰度表达基因154个,占所有TUT的7.8%,代表342个EST,占总EST的13.30%。低丰度单拷贝的EST 1771个,占总EST的68.86%,说明文库的复杂性较好。 利用BlastX对1977个TUT进行注释,其中720个TUTs有明确的功能注释,占总TUTs的36.42%;109个为未知蛋白,占总TUTs的5.51%,其余1238个则没有明显同源性而被鉴定为新基因,占总TUTs的62.62%。将720个TUT分成代谢、能量、光合作用、蛋白合成、转运组件、转录、信号传导、细胞救援与防御和其它等九类,其中代谢、能量和光合所占的比例最高,分别达到22.90%、12.25%和11.86%,而细胞救援与防御类所占比例较低,仅为1.24%,从而确定叶部虽然受到了NaHCO_3胁迫,但其主要功能如光合作用、代谢和能量仍处于主导地位,这也在一定程度上说明了西伯利亚蓼具有耐胁迫能力。 2.以SMART策略构建了西伯利亚蓼NaHCO_3胁迫48h的叶部和茎部正反消减文库,随机挑取克隆测序,共获得了2282条有效序列,其中茎的正向消减文库中有598条,茎的负向消减文库中有490条,叶的负向消减文库中有567条,叶的正向消减文库中有627条。通过进行MIPs功能分类并对茎部与叶部正反消减文库比较,在盐胁迫条件下,发现茎部与叶部的胁迫反应有很大不同,茎部与叶部除细胞救援与防御、转运组件组中变化趋势相同外,在代谢、能量、光合作用、蛋白合成、转录、信号传导等方面均表现为相反的趋势,其中茎部表现为胁迫抑制的有转运组件、转录和蛋白质合成,而在叶部则表现为胁迫诱导。在茎部表现为胁迫诱导的光合作用、信号转导、能量以及代谢,在叶部则表现为胁迫抑制。说明叶部与茎部在NaHCO_3条件下具有两种不同应答机制和分工,结合以往的研究结果,确定茎部在西伯利亚蓼的个体植株水平耐盐机制中起到重要作用。 3.利用RACE技术克隆了17个与胁迫有关的cDNA,并进行了生物信息学分析,确定17个胁迫相关基因为水通道蛋白基因、胚胎晚期富集蛋白基因、乙二醛酶Ⅱ基因、臭氧反应胁迫相关蛋白基因、谷氧还蛋白基因、超氧化物歧化酶(Mn)、超氧化物歧化酶(Cu-Zn)、广泛应激蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、铜伴侣、钙调蛋白、谷胱甘肽转硫酶、半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白、Aci-还原酮双加氧酶、泛素蛋白连接酶/锌结合蛋白,通过已有的研究结果表明其中胚胎晚期富集蛋白基因、乙二醛酶Ⅱ基因、超氧化物歧化酶(Mn)、超氧化物歧化酶(Cu-Zn)、谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白等基因具有潜在的耐盐碱功能,为耐盐基因工程育种的潜在基因资源。


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