露地菊耐低温特性研究及遗传转化体系的构建

【摘要】： 露地菊(Dendranthema×gandiflorum)是重要的园林绿化花卉之一,具有植株低矮,开花繁密,耐粗放管理等特性,有一定的社会经济价值。但是其盛花期通常处于深秋季节,往往因温度骤降导致观赏价值降低。通过遗传转化途径引入重要的抗逆基因,有望提高菊花抵御低温的能力。本研究以11个北方主要栽培露地菊品种(‘金不换'、‘矮红'、‘蜂窝粉'、‘雪涛'、‘秋艳'、‘粉玫瑰'、‘紫秋裳'、‘富丽'、‘金凤凰'、‘东林瑞雪'、‘袖珍红')和以这些品系为母本,在杂交子代中选育的16个综合性状优良的露地菊品系(‘东林1号'、‘东林2号'、‘东林3号'、‘东林4号'、‘东林5号'、‘东林6号'、‘东林7号'、‘东林9号'‘东林9号'、‘东林9号'、‘东林11号'‘东林12号'‘东林13号'、‘东林14号'、‘东林15号'、‘东林16号')为试材,在对这27个露地菊品种和品系耐低温能力筛选的基础上,选择其中耐寒能力较强的4个露地菊品系和品种,进行了以叶片为外植体直接诱导不定芽的研究。同时从拟南芥中克隆了AtproDH和P5CS基因,并应用Gateway克隆技术构建了植物表达载体,进行P5CS基因转化露地菊的研究。 主要研究结果如下: 1、露地菊抗冻品种和品系的筛选 利用受伤率和伤害指数两项指标对27个露地菊品系进行耐低温筛选,筛选出‘金不换'、‘雪涛'、‘富丽'、‘东林4号'、‘东林6号'、‘东林9号'、‘东林13号'等7个耐低温品系,同时发现‘粉玫瑰'、‘东林1号'、‘东林2号'三个品系的耐低温能力最差; 通过对不同自然低温处理时期,7个品系的电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶、果糖、葡萄糖和可溶性糖等指标的测定发现,‘雪涛'和‘东林4号'的耐低温能力要强于其它品系,尤其是‘东林4号'对低温的调节能力较强,在低温胁迫下,能够调节渗透途径减轻低温的伤害。 2、低温胁迫下,露地菊蛋白质表达谱分析 利用二维液相色谱技术,分离了‘东林4号'露地菊品系的低温处理和对照样品的总蛋白,通过ProteoVue软件分析发现:处理样品与对照相比共有蛋白差异点36个,其中显著增强表达的蛋白差异点有26个。选取10个差异色谱峰,经过蛋白质质谱鉴定了3个植物耐低温相关蛋白质,分别是:假定的钙离子运输ATP酶,铁氧还-硫氧还蛋白还原酶,假定的细胞色素C氧化酶。 3、抗冻基因的克隆及植物表达载体的构建 通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了P5CS和AtproDH的cDNA全长基因。利用Gateway克隆技术分别构建了AtproDH和P5CS两个基因的植物表达载体。 4、露地菊遗传转化体系的建立 建立‘东林4号'、‘东林6号'、‘东林9号'叶片外植体再生体系,发现不同基因型叶片外植体的分化率差异明显。‘东林9号'的叶片外植体分化率最高。‘东林13号'未获得以叶片为外植体的不定芽。‘东林4号'最适分化培养基为:MS+3 mg/L BA+0.1mg/L2,4-D,叶片分化率为10%;‘东林6号'最适分化培养基为:MS+2 mg/L BA+1 mg/LNAA,叶片分化率为82%;‘东林9号'最适分化培养基为:MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/LNAA,该品系植株上层幼嫩叶片分化率为95%,中下层叶片分化率均小于50%; 潮霉素对以叶片为外植体的分化起到很强的抑制作用,在潮霉素含量为5 mg/L的培养基中叶片即可失去分化能力。‘东林9号'品系组培再生芽在含有30 mg/L潮霉素的培养基中全部死亡。 通过农杆菌LBA4404介导,初步建立了P5CS基因转入露地菊的遗传转化体系,经过PCR鉴定得到了一个阳性株系。