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聚磷菌的筛选及其体内聚磷酸盐推动PHB积累的研究

孙艺萍  
【摘要】: PHB是细菌在不利于生长和营养失衡的条件下胞内大量积累的聚羟基酯。其作为合成聚合物的替代品具有很多优点,它不仅具有可生物降解性和生物相容性,而且还能以可再生资源作为生产原料。 本研究以污水处理厂的活性污泥为样品,从中筛选出三株高效聚磷菌。对此三株菌从形态特征、生理生化指标、16SrDNA三方面进行鉴定,确认此三株聚磷菌分别为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Pseudochrobactrum saccharolyticum、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),并将三株菌分别编号为YPS-1、YPS-2和YPS-3。 选取聚磷菌YPS-2进行聚磷培养基及培养条件的优化。本试验设计好氧/厌氧两段式工艺进行微生物胞内合成与积累聚-β-羟基丁酸(PHB)。以菌体生长和聚磷能力为指标,通过摇瓶培养发酵,对培养基中碳源、氮源和磷源进行优化,试验确定的碳源为CH_3COONa、氮源为(NH_4)_2SO_4、磷源为KH_2PO_4。通过单因子试验、正交试验对好氧阶段菌体生长及聚/释磷条件进行优化,得到对聚磷菌YPS-2聚磷的最适培养基成分及其浓度为:碳源浓度1%、氮源浓度0.1%、磷源浓度100 mg/L;最佳条件为:培养基初始pH值为7、培养温度为30℃、接种量为10%、培养时间为72h。优化的聚磷条件为典型周期的研究提供了理论基础。 厌氧培养营养成分对菌体释磷及PHB的积累有重要影响,通过对四种营养条件(缺N、缺P、缺N、P、全营养)下,菌体生长、释磷率、PHB积累情况的研究,发现营养均衡有利于菌体生长,但缺少氮源和磷源的培养有利于菌体释磷和PHB的积累,充分说明PHB需在不平衡生长条件下得以积累。 好氧/厌氧典型周期中菌体在好氧阶段生长旺盛,厌氧阶段基本不生长;聚磷量和释磷量则随时间的增加而增加,但厌氧释磷需时较长。聚磷量、释磷量、单位质量干细胞中PHB所占比重与时间均存在一定的线形关系,随时间的增加而增加,但其增加幅度各有不同。在最佳发酵条件下,经好氧/厌氧交替培养后菌体聚磷量超过70mg/L、释磷量超过45mg/L、单位质量干细胞中PHB所占比重达55%以上。较好地实现了生物除磷与PHB的积累。 为了提高PHB产率,对收集的菌体进行预处理发现SDS/EDTA混合液具有较好的破壁效果。通过正交试验优化PHB提取条件,优化结果为:NaClO浓度为30%、NaClO/CCl_4(V/V)=3:1、温度为40℃、时间为24h。与未优化前的PHB产率相比,优化后PHB大幅提高,大约为优化前的2倍。样品与标准品的红外分析光谱表明,样品中含有PHB,为进一步PHB的提取与定性分析提供了参考。


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