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锌指蛋白基因的克隆及遗传转化的研究

赵楠  
【摘要】: 露地菊(Chrysanthemum morifolium)是园林绿化观赏植物中常用的花卉之一。其花量多、花色丰富,观赏价值较高。为阐释露地菊的抗盐碱分子机制,本研究以耐盐碱品系‘阳光'为实验材料,克隆获得一新的锌指蛋白基因(CmSTZF),经结构分析、同源性分析以及转化烟草等实验研究,证明其与植物耐盐性密切相关。在这些研究的基础上,应用Gateway克隆技术分别构建了露地菊和水稻锌指蛋白基因的植物表达载体,并进行了CmSTZF基因转化露地菊的研究。 主要研究结果如下: 1.利用RT-PCR技术从150mM碳酸钠处理的露地菊‘阳光'叶片中分离得到一个锌指蛋白cDNA全长克隆。测序分析其全长794bp,编码170个氨基酸,蛋白分子量大小为18.1KDa,属AN1型锌指,其锌指保守序列为C-X_2-C-X_((9-12))-C-X_((1-2))-C-X_4-C-X_2-H-X_5-H-X-C,命名为CmSTZF(Chrysanthemum morifolium stress-tolerance zinc finger)(GenBank accession no.DQ864730)。该锌指蛋白与多种植物逆境相关蛋白具有同源性。三维结构模拟显示该锌指结构域与水稻OSISAP1蛋白锌指结构域空间结构一致。 2.利用Gateway技术成功构建了露地菊锌指蛋白基因CmSTZF的表达载体pH7WG2D-CmSTZF及水稻锌指蛋白基因OsISAP1的表达载体pH7WG2D-OsISAP1。并转入农杆菌菌株LBA4404,建立了农杆菌介导的烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得转CmSTZF的转基因烟草株系2株。在Na_2CO_3胁迫下转基因株系与对照相比表现出明显的抗逆性,表明露地菊锌指蛋白基因与植物的抗盐性密切相关。 3.对露地菊叶片的再生体系进行了优化。‘东林9号'最适分化培养基为:MS+0.5mg/L BA+1.5mg/L NAA,叶片分化率为90%。同一基因型处于不同生理状态的叶片再生能力差异显著。该品系上部叶片分化频率高达92%,中下层叶片分化率均小于50%;不同基因型叶片外值体分化率差异显著。以露地菊‘东林9号'、‘东林11号'、‘东林13号'、‘阳光'、‘粉玫瑰'、‘金不换'、‘东林瑞雪'、‘富丽'、‘雪涛'、‘秋艳'的叶片为外植体,进行不定芽诱导试验。其中‘东林9号'分化率最高,达到91.55%。而‘东林13号'、‘粉玫瑰'、‘金不换'、‘东林瑞雪'分化率均低于10%。‘东林9号'幼叶在MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L的培养基上进行一定时间的预培养后再转入分化培养基,可以提高再生频率。预培养时间在2-6d内再生频率都能达到90%以上。 4.露地菊转化体系的优化。潮霉素对以叶片为外植体的分化起到很强的抑制作用,叶片在10mg/L Hyg的培养基中分化的能力即下降了很多,在20、25mg/L Hyg的培养基中表现为全部死亡。既能有效的抑菌又能最大限度的保证叶片再生的脱菌浓度为100mg/L的Carb。本试验中探讨的最适侵染时间为30min,转化率为1.59%;最适共培养时间为3d,转化率为1.57%;最适延迟筛选时间为15d,转化率为1.43%;侵染时菌液中乙酰丁香酮的加入可使转化效率明显提高,但共培养时培养基中加入的乙酰丁香酮则无明显影响。 5.采用农杆菌LBA4404介导,建立CmSTZF基因转入露地菊的遗传转化体系,经PCR检测有一个株系为阳性。


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