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电针预处理调控肠道菌群与Th17/Treg免疫平衡降低大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制研究

张继瑶  
【摘要】:实验一电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群结构的影响目的:观察电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠神经功能和肠道菌群结构的影响。方法:将36只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,即假手术组、模型组、电针预处理组,每组12只。电针预处理组给予2周的百会穴和足三里穴电针预处理,其余两组仅给予同等条件的抓取。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注12h、1d、3d、7d,采用改良神经功能缺损评分评价大鼠的神经功能、大小鼠抓力测定仪对大鼠的前肢抓握力量进行测定并统计和记录大鼠再灌注7 d内的存活率;再灌注7 d,采用TTC染色测定脑梗死体积,应用HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度,应用高通量16S rDNA V3-V4区测序分析肠道菌群多样性。结果:1.改良神经功能缺损评分:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠改良神经功能缺损评分显著升高(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠改良神经功能缺损评分显著降低(P0.05)。2.前肢抓握力量测试:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠前肢抓握力量显著降低(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠前肢抓握力量显著升高(P0.05)。3.存活率:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠存活率(46.15%)显著降低(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠存活率(80.00%)显著升高(P0.05)。4.TTC染色:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死体积显著增大(P0.05);与模型组比较,电针预处理组脑梗死体积显著缩小(P0.05)。5.HE染色:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显减轻。6.16S rDNA V3-V4 区测序:从门水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内变形菌门(Proteobacteria),TM7和柔壁菌门(Tenericutes)的相对丰度显著升高(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内变形菌门(Proteobacteria),TM7和柔壁菌门(Tenericutes)的相对丰度显著降低(P0.05)。从科水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内毛螺菌科(Lachnospiraceae)和双歧杆菌科(Bifidobaceartaceie)的相对丰度显著降低(P0.05),明串珠菌科(Leuconostocaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的相对丰度显著升高(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内明串珠菌科(Leuconostocaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的相对丰度显著降低(P0.05)。从属水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内乳酸杆菌(Lactobacillus),粪球菌属(Coprococcus),双歧杆菌属(Bifidobacterium),布劳特氏菌属(Blautia)和普雷沃氏菌(Prevotella)的相对丰度显著降低(P0.05),Clostridaceae_Clotridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度显著升高(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内乳酸杆菌(Lactobacillus),布劳特氏菌属(Blautia)和普雷沃氏菌(Prevotella)的相对丰度显著升高(P0.05),Clostridiaceae_Clostridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度显著降低(P0.05)。肠道菌群与mNSS评分相关性分析显示,在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、TM7和柔壁菌门(Tenericutes)的相对丰度与mNSS评分呈正相关(P0.05);在科水平上,明串珠菌科(Leuconostocaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的相对丰度与mNSS评分呈正相关(P0.05);在属水平上,Clostridiaceae_Clostridium和瘤胃球菌属Ruminococcus]的相对丰度与mNSS评分呈正相关(P0.05),乳酸杆菌(Lactobacillus),布劳特氏菌属(Blautia)和普雷沃氏菌(Prevotella)的相对丰度与mNSS评分呈负相关(P0.05)。结论:电针预处理可下调脑缺血/再灌注大鼠盲肠内容物内变形菌门(Proteobacteria),TM7、柔壁菌门(Tenericutes)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、肠杆 菌科(Enter obacteriaceae)、Clostridiaceae Clostridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度,上调乳酸杆菌(Lactobacillus)、布劳特氏菌属(Blautia)和普雷沃氏菌(Prevotella)的相对丰度,减轻缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度,缩小脑梗死体积,降低死亡率及神经功能缺损。实验二电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠Th17/Treg免疫平衡的影响目的:观察电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠Th17/Treg免疫平衡及相关炎症因子表达的影响。方法:将36只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,即假手术组、模型组、电针预处理组,每组12只。电针预处理组给予2周的百会穴和足三里穴电针预处理,其余两组仅给予同等条件的抓取。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2 h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注7 d,采用免疫组化检测缺血侧皮层、结肠组织IL-17A、IL-10蛋白的表达,采用Western blotting检测缺血侧皮层和结肠组织中IL-17A、IL-10蛋白的表达,及缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织中RORγt、Foxp3蛋白的表达,应用Elisa测定大鼠腹主动脉血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-βl的含量,分析缺血侧皮层RORγt、Foxp3蛋白表达与mNSS评分的相关性。结果:1.免疫组化:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织中IL-17A,IL-10蛋白的平均光密度值显著升高(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织中IL-17A蛋白的平均光密度值显著降低,IL-10蛋白的平均光密度值显著升高(P0.05)。2.IL-17A、IL-10蛋白表达:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A、IL-10蛋白表达量显著增加(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A蛋白表达量显著减少,IL-10蛋白表达量显著增加(P0.05)。3.RORγt、Foxp3蛋白表达:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt、Foxp3蛋白表达量显著增加(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt蛋白表达量显著减少,Foxp3蛋白表达量显著增加(P0.05)。4.血清Elisa:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠腹主动脉血清内炎性因子IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量均显著增加(P0.05);与模型组比较,电针预处理组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23含量显著减少,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显著增加(P0.05)。5.RORγt、Foxp3蛋白与mNSS评分相关性分析:再灌注7d,缺血侧皮层RORγt、Foxp3蛋白的表达与mNSS评分呈正相关(P0.05);电针干预下,缺血侧皮层RORγt蛋白的表达与mNSS评分呈正相关(P0.05),Foxp3蛋白的表达与mNSS评分呈负相关(P0.05)。结论:1.电针预处理可下调缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A表达,上调IL-10表达,降低外周IL-17A、IL-23含量,升高IL-10、TGF-β1含量,减轻脑缺血后肠道-中枢炎症损伤;2.电针预处理可下调缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt表达、上调Foxp3表达,调控Th17/Treg免疫平衡,发挥脑-肠保护作用。实验三电针预处理通过肠道菌群诱导脑缺血耐受的免疫机制研究目的:观察菌群剔除及菌群移植(电针预处理2周后菌群)对脑缺血/再灌注大鼠神经功能及相关炎症因子表达的影响。方法:将60只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、ABX-Pre+模型+FMT组、ABX-Pre+模型+PBS组、ABX+模型组,每组12只。整个实验过程中,假手术组、模型组给予无菌饮水;ABX-Pre+模型+FMT组、ABX-Pre+模型+PBS组在造模前给予2周的抗生素饮水,模型制备后给予无菌饮水;ABX+模型组在造模前给予2周的抗生素饮水,模型制备后继续给予抗生素饮水。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2 h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注12 h、1d、3d、7 d,采用改良神经功能缺损评分评价大鼠神经功能、大小鼠抓力测定仪对大鼠的前肢抓握力量进行测定;再灌注7 d,应用HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度,采用免疫组化检测缺血侧皮层IL-17A、IL-10蛋白的表达,应用Elisa测定大鼠腹主动脉血清 IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1 的含量。结果:1.改良神经功能缺损评分:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠改良神经功能缺损评分显著升高(P0.05);与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠改良神经功能缺损评分显著降低(P0.05),ABX-Pre+模型+PBS组大鼠改良神经功能缺损评分显著升高(P0.05);与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠改良神经功能缺损评分显著升高(P0.05)。2.前肢抓握力量测试:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠前肢抓握力量显著降低(P0.05);与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠前肢抓握力量显著升高(P0.05),ABX-Pre+模型+PBS组大鼠前肢抓握力量显著降低(P0.05);与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠前肢抓握力量显著降低(P0.05)。3.HE染色:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显减轻,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重。4.免疫组化:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层IL-17A,IL-10蛋白的平均光密度值显著升高(P0.05);与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显著降低,IL-10蛋白的平均光密度值显著升高(P0.05),ABX-Pre+模型+PBS组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显著升高,IL-10蛋白的平均光密度值显著降低(P0.05);与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显著升高,IL-10蛋白的平均光密度值显著降低(P0.05)。5.血清Elisa:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠腹主动脉血清内炎性因子IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量均显著增加(P0.05);与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显著减少,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显著增加(P0.05),ABX-Pre+模型+PBS组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显著增加,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显著减少(P0.05);与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显著增加,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显著减少(P0.05)。结论:电针预处理可通过肠道菌群减轻脑缺血/再灌注大鼠缺血侧皮层和结肠组织的病理损伤程度及肠道-中枢炎症损伤,改善神经行为学功能。


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