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分析耐盐基因与启动子功能的CRE/loxP重组激活系统的构建与检验

朱莹  
【摘要】: 非生物胁迫严重影响植物的正常生长发育,利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。克隆新的逆境诱导型启动子与抗逆基因,将诱导型启动子成功应用于转基因植物中,调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的发展方向,而如何客观科学地评价启动子和目标基因的功能是关键。但目前,用于抗逆基因与启动子功能鉴定与表达调控分析的体系都有其局限性。对此,本研究以诱导型启动子(AtRD29A和AtHsp18.2启动子)与耐盐基因(TvNHX1和AtNHX1)为试材,构建基于CRE/loxP载体的重组激活系统;利用CRE/loxP重组系统与GAL4-VP16/UAS双因子反式激活系统互作,结构基因与报告基因GFP能够时空同步表达的原理,通过检测经NaCl诱导的转基因拟南芥中GFP表达和植株的表型性状,可快速、有效地鉴定启动子和结构基因的功能,建立了一套适于分析抗逆基因与启动子功能的载体系统。主要研究结果如下: 克隆拟南芥RD29A启动子;将RD29A启动子、碱菀TvNHX1和拟南芥AtNHX1基因引入CRE/loxP重组系统中,构建由不同启动子调控的、带有不同耐盐基因的植物表达载体pGII-TvNHX1-HSCREN_2、pGII-AtNHX1-HSCREN_2、pGII-RD29ACREN_2和pGII-TvNHX1-RD29ACREN_2;通过冻融法分别将植物表达载体和辅助质粒pSoup共导入农杆菌C_(58)C_1中。 应用农杆菌介导的蘸花法,通过双菌株/双质粒的共转化,将4个载体组合pGII-TvNHX1-HSCREN_2/pI-GFP、pGII-AtNHX1-HSCREN_2/pI-GFP、pGII-RD29A CREN_2/pI-GFP和pGII-TvNHX1-RD29ACREN_2/pI-GFP转入拟南芥中。部分T0代种子经8 mg/L PPT和10 mg/L HYG双抗性筛选,得到103株抗性植株;经过对抗性基因PPT和HYG及目的基因TvNHX1的PCR检测,证实28株为共转化植株。 选取PCR鉴定阳性的各转化组合T_1代植株叶片,经250 mM NaCl胁迫处理,4个载体组合的转基因植株叶片中均检测到GFP,证实成功进行了共转化;并证明AtRD29A启动子和AtHsp18.2启动子均受NaCl诱导,CRE/loxP重组激活系统有效。 对部分T_O代种子经8 mg/L PPT筛选获得47个转基因抗性植株,经250 mM NaCl胁迫处理,能够正常生长的植株检测到不同程度的GFP表达。结果表明,构建的CRE/loxP载体激活系统应用于评价耐盐基因与启动子功能具有可行性。


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