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利用Cre/loxP重组激活系统对耐盐基因和启动子的功能分析

陈广东  
【摘要】:利用植物基因工程技术培育耐盐新品种,是提高作物耐盐性的主要措施之一。科学有效的对耐盐基因和其调控元件进行评价是深入研究植物耐盐机理的关键。对此,本试验利用Cre/loxP重组激活系统,构建了含AtNHX1或TvNHX1基因、rd29A或Hsp18.2启动子的植物表达载体,并获得拟南芥共转化体。对4种转化体进行NaCl处理,盐胁迫可诱导Cre/loxP系统中rd29A或Hsp18.2启动子激活Cre,进而激活一系列相关反应使目的基因与GFP时空共表达。通过表型观察、生理指标测定、GFP观测和相关基因的表达检测,对AtNHX1和TvNHX1基因、rd29A和Hsp18.2启动子进行了功能分析。主要结果如下: 构建植物表达载体pGII227-UASAtNHX1-rd29ACREN和pGII227-UASTvNHX1-rd29ACREN。通过电击转化法分别将两个表达载体转入了含有助质粒pSoup的农杆菌C58C1中。 利用农杆菌介导的共转化法,将两个载体组合pGII227-UASAtNHX1-rd29ACREN/pI-GFP(rd29A-At)、pGII227-UASTvNHX1-rd29ACREN/pI-GFP(rd29A-Tv)分别转入拟南芥中。T1代转基因植株经过8mg/l PPT、15mg/l Hyg抗性筛选、PCR检测,阳性率分别为7.7%和3.7%。 对转基因植株rd29A-At、rd29A-Tv和pGII227-UASTvNHX1-HspCREN/pI-GFP(Hsp-tv)、pGII227-rd29ACREN/pI-GFP(CREN)进行NaCl胁迫处理(时间梯度:200mM NaCl胁迫5d、10d、15d;浓度梯度:150mM、200mM、300mM NaCl胁迫5d),通过表型观察、叶片叶绿素含量测定、激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达及对比靶基因表达的半定量RT-PCR分析等研究,得出4种转基因植株对盐的耐受力依次为:rd29A-Atrd29A-TvHsp-tvCREN。据此结果及对不同类型的转基因植株间的分组比较揭示:启动子rd29A比Hsp18.2更好响应盐胁迫;AtNHX1比TvNHX1更能提高拟南芥植株的耐盐性,由此反映出内源基因过表达能更好提高植株的耐盐性;证实本研究构建的Cre/loxP重组激活体系是分析评价抗逆基因及其调控元件功能的高效可行的系统。


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