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枯草芽孢杆菌发酵合成聚γ-谷氨酸的研究

王风青  
【摘要】:γ-聚谷氨酸是一种由微生物代谢合成的均聚氨基酸高分子聚合物,具有极佳的成膜性,成纤维性,阻氧性,可塑性,保湿性,可降解性,可食用性,是一种对人体和环境无毒害的可生物降解的新型天然高分子,广泛用于食品,化妆品,医药,农业,石油脱水等行业。 主要研究了γ-聚谷氨酸的液体摇床最佳培养基配方和发酵条件,5L小型发酵罐的最佳培养条件,最佳提取纯化条件及样品表征分析,部分性质及应用的探索,研究结果显不: 1.通过单因素实验和响应面分析法对液体摇瓶发酵条件下枯草芽孢杆菌发酵产γ-PGA的培养基成分及培养条件进行了优化,结果表明:枯草芽孢杆菌为谷氨酸依赖型菌株,其发酵合成γ-PGA的最佳培养基组成为:玉米糖化液(含还原糖20%)6.07%、普通蛋白胨0.42%、前体物谷氨酸钠7.34%、硫酸镁0.15%、硫酸锰0.006%、磷酸二氢钾0.8%、氯化钠1%、氯化钙0.03%;最佳培养条件为:初始pH6.5、接种量2%、装液量50mL/250mL、150r/min、37℃培养84h,优化后γ-PGA的产率从57.85g/L升高到68.3 g/L,比优化前提高了10.45 g/L。 2.在5L发酵罐上分别考察发酵罐搅拌器转速、通气量和发酵过程中pH对发酵合成γ-PGA的影响,结果表明:发酵过程控制pH在6.5,通气量为8L/min,同时在100r/min的转速下,γ-PGA的产率为39g/L,比优化前提高了6.5g/L。 3.在对γ-PGA的提取研究中,有机溶剂提取法要优于金属盐溶液,有机溶剂提取的产物弹性较好。有机溶液乙醇浓度越大越好,即无水乙醇,溶剂/发酵液比例以5为佳;将除菌体的发酵液在100℃条件下处理一定时间,γ-PGA的提取率为27.28g/L,当在4℃,40℃,60℃下处理同等时间时,γ-PGA的提取率仅有小幅度的变化,可见温度对提取效果没有太大影响;pH值对提取效果影响较大,当pH值为6时提取效果最好,加酸或加碱都使发酵液黏度降低同时也使提取率下降,当将pH值回调至6时并不能使黏度恢复,说明酸碱使聚合物发生了不可逆变化。 4.样品纯度分析,实验结果显示:将无水乙醇提取的样品加6mol/L盐酸,在110℃下水解2h,与标准谷氨酸一起进行硅胶薄层层析,用茚三酮显色,只得到相当于标准谷氨酸的斑点,也就是说水解液不存在其它氨基酸,而且也不存在其它蛋白质,因而可以断定层析样是由单一的谷氨酸组成的,而且乙醇在提取时也未携带菌体分泌的一些蛋白类物质;用5300DV等离子体发射光谱仪对无水乙醇一次提取后透析过夜的样品进行了离子分析,样品中所含金属离子大约在70.1086 mg/g,即1g的样品中含有不到0.1g的金属离子,由此说明透析可除去大部分金属离子杂质;γ-PGA的最佳干燥方式是冷冻干燥。 5.样品结构表征的初步分析,实验结果显示:对透析过夜的样品进行红外光谱测定和紫外扫描,初步断定所提样品是γ-PGA,且其最大紫外吸收波长位于216 nm处,紫外扫描图谱只出现一个峰,而且在280nm和260nm处均无特征性吸收峰,说明该聚合物没有典型的肽链结构不属于蛋白类物质同时也不属于核酸;用凝胶电泳和凝胶渗透色谱法对γ-PGA的分子量进行了分析,SDS电泳法测定出聚合物的分子量在600-700kDa之间,GFC法测定分子量为960kDa;用电镜对γ-PGA的冻干样进行了观察,照片显示冷冻干燥并没有破坏γ-PGA的内部结构。 6.γ-PGA的部分性质及应用试验,结果表明:γ-PGA可与多数金属离子发生絮凝反应,特别是对Cr3+、Cu2+和Fe3+,絮凝效果特别明显。另外,γ-PGA对Zn2+、Mn2+、Ag+等离子也有一定的絮凝作用,因此,可以考虑将γ-PGA用于污水处理中;以1%、3%、5%不同浓度的γ-PGA分别作为干酪乳杆菌的保护剂,5%的海藻糖为对照,经36h冷冻干燥冻干成粉之后进行平板计数,同等稀释倍数下5%γ-PGA做保护剂时的活菌数等同于5%的海藻糖,1%和3%的γ-PGA做保护剂时的活菌数均少于5%,且浓度越低活菌数越少;在面团中加入0.03%的γ-PGA,以不加γ-PGA的为对照,将揉搓好的面团置于-30℃冰箱中速冻,冷藏14天后,解冻省发,蒸制并拍照,图片显示加了γ-PGA的馒头气孔较大,可能是因为γ-PGA在冷冻期间对其醒发酵母起到了保护作用所致,而且并无任何异味,由此可尝试作为食品添加剂用于各种速冻食品。


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