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吴茱萸碱诱导人肝癌细胞HepG_2细胞周期阻滞机制研究

刘溪  
【摘要】:吴茱萸碱(Evodiamine, Evo)是传统中药材吴茱萸的主要有效成分,它是一种色胺吲哚类生物碱。国内外研究表明,吴茱萸碱具有很强的药理活性,而其抗肿瘤的作用是其重要的药理作用之一,对多种肿瘤均具有抑制作用,并且可通过多种途径发挥抗肿瘤活性,如促进肿瘤细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞于某一时相、抑制肿瘤细胞新生血管形成等;但是吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的细胞周期阻滞作用机制还尚不明确,因此本实验为了阐明其作用机制,对进一步研究开发吴茱萸碱这种低毒、高效的中药有效成分具有重要的意义。 本实验采用体外实验方法,对吴茱萸碱诱导人肝癌细胞HepG2细胞周期阻滞的机制进行研究。采用MTT法测定吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的细胞毒作用;以细胞克隆集落形成实验检测吴茱萸碱对HepG2增殖能力的影响;应用流式细胞仪(FCM)检测吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响;以激光共聚焦显微镜(LSCM),结合免疫荧光法观察分析吴茱萸碱对HepG2细胞中微管蛋白(a-tubulin)聚合态的影响;采用WesternBlot法分析吴茱萸碱对周期蛋白CyclinB1、周期蛋白依赖性激酶CDK1表达水平的调控。 由研究结果表明,(1)MTT法结果显示吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2具有细胞毒作用,并呈现剂量依赖性即随吴茱萸碱给药浓度的增大细胞毒作用增强,由计算得出其IC5o为19.62μmol/L;吴茱萸碱亦能够抑制HepG2细胞集落的形成,具有量-效关系,即提高吴茱萸碱浓度时形成大于50个以上的细胞集落减少,即抑制率增强。(2)经流式细胞仪分析,以2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L三种浓度的吴茱萸碱作用于人肝癌HepG2细胞24h后,与阴性对照组相比处于G2/M期的细胞比例显著增加,具有剂量依赖关系,有统计学意义,说明吴茱萸碱将人肝癌HepG2细胞周期阻滞于G2/M期。(3)采用间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观察发现,吴茱萸碱作用24h后影响了人肝癌HepG2细胞内微管蛋白聚集形态,在阴性对照组中,微管蛋白为有序的、清晰的网络状分布,而经吴茱萸碱给药后微管蛋白原有的分布形态消失,呈现紊乱、弥散状,由此推断这种结构形态的改变必定会影响细胞有丝分裂的正常进行,是导致细胞周期阻滞的重要原因。(4)Western Blot法分析不同浓度吴茱萸碱作用于人肝癌细胞HepG224h后,吴茱萸碱可使细胞周期蛋白CyclinB1和细胞周期依赖性蛋白激酶CDK1的蛋白表达水平显著增加,具有统计学意义,但低剂量吴茱萸碱不能显著上调CDK1的水平。 通过以上体外实验研究证明了,吴茱萸碱可显著抑制肿瘤细胞的生长及其有丝分裂,对人肝癌细胞HepG2具有显著的抗肿瘤活性。吴茱萸碱对HepG2发挥抗肿瘤作用途径之一为对细胞周期产生阻滞,将其阻滞于G2/M期,导致肿瘤细胞的增殖抑制,而发生这种周期阻滞的机制可能是吴茱萸碱上调G2/M期细胞周期调控因子CyclinB1和CDK1的转录表达,进一步影响在有丝分裂中起到重要作用的微管的形态及功能,即影响微管蛋白的动态平衡,干扰肿瘤细胞无限分裂的进行,最终实现抗肿瘤的药理作用。


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