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芩白清肺合剂的制备与抗炎作用的研究

于充  
【摘要】:目的:急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是一种常见疾病,在急性发作的疾病中,它对人体的危害极大。目前,临床的治疗与治愈方式多为高剂量给氧,或者利用地塞米松等激素类药物进行治疗,其发病状况急、发病进程快速并存在肺水肿等一系列的并发症,迫切需要一种新的预防和治疗方式。中医组方与中药合剂是传统的医学治疗方式。本实验中的中医组方,在临床的实践中具有一定的清肺化痰作用。因此,本实验在一定临床基础的前提下,对芩白清肺合剂进行质量控制,提取制备,同时利用数据分析对关键通路进行预测及药效学研究。方法;按照2020年《中国药典》版本中的规定,对芩白清肺合剂进行水提取,正交优化设计。考察因素是加水量倍数、提取时间、提取次数三个因素进行分析。根据出膏率与君药黄芩苷的含量进行评分,筛选出最佳工艺,过200目筛,添加防腐剂等方式增加其保存时间。进行梯度浓缩后,根据数据分析得到成型工艺,最后灌装成袋。在质量控制的实验中建立了黄芩、款冬花、瓜蒌、连翘、白屈菜五味中药的薄层鉴别,进行了稳定性、重复性、加样回收率、精密度等试验,确定了芩白清肺合剂中黄芩苷含量的液相测定方式。随后进行了微生物,pH等标准的考察。据网络药理学的数据分析,筛选出中药组方中各味中药的治疗靶点和作用靶点,利用构图和数据挖掘出潜在的治疗靶点,同时筛选出关键的治疗通路,进行后续的实验。最后利用大鼠暴露气管进行滴注诱发的急性肺损伤模型,进行后续的药效学分析,将大鼠分为6组,分别为空白组(B)模型组(M)地塞米松组(DEX)高剂量组(H)中剂量组(MID)低剂量组(L)进行两周的预防给药之后造模,24h后进行检测与治疗,进行大鼠的一般活动状态、肺通透性、BALF(肺泡灌洗液)中细胞总数、炎性因子的改变、肺组织病理学变化与评分、腹主动脉血中的指标、血气分析、肺组织中氧化应激的指标等指标的检测,之后利用Western Blot的方式,对数据挖掘出的结果进行通路的验证,得到合理的结果。结果;芩白清肺合剂的制备工艺是加入14倍量的水、提取时间为1h、提取次数为3次后合并水提的汤剂。冷却至室温后过200目筛,过滤残渣静置后取上清液进行浓缩,浓缩至100ml,再加入防腐剂山梨酸0.2%与娇味剂蔗糖混匀,pH值调至4.5~5.5,机器分装。质量控制中确定了黄芩、款冬花、瓜蒌、连翘、白屈菜五味中药的薄层鉴别,利用高相液相色谱法测定黄芩苷的含量,得到黄芩苷的回归方程是A=4E+07C-76287,R2=0.9996,线性范围是 0.017~0.272mg/ml,加样回收率是 99.212%,RSD 值是0.41%。确定建立的测定方式可行之后,进行网络药理学靶点的预测,据数据分析认为TNF,NF-κB是芩白清肺合剂治疗急性肺损伤(ALI)的关键通路。同时MPO(髓过氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)、IL-1β(白介素1)、IL-6(白介素6)等靶点也是关键靶点。在随后的Western Blot实验中也验证了预测的结果。随着芩白清肺合剂的浓度上升,目的蛋白变淡,证明药物具有一定的治疗效果,也验证了网络药理学的预测。在药效学研究中(1)通过对大鼠肺表面通透性BCA蛋白的浓度、肺干湿重的检测发现与模型组(M)相比芩白清肺合剂高剂量组(H)能够明显的减轻肺的水肿程度,减少肺的通透性(p0.05)。(2)通过检测BALF中细胞总数发现与模型组(M)相比芩白清肺合剂高剂量组(H)能够减缓疾病的进展,能够争取更多的治疗时间。(3)大鼠血气分析的改变,与模型组(M)相比发现芩白清肺合剂高剂量组(H)能够减轻氧合指数的下降(p0.05)。(4)利用ELISA检测BALF(肺泡灌洗液)中TNF-α(肿瘤坏死因子)、IL-1β、IL-6炎症因子,发现与模型组(M)相比芩白清肺合剂高剂量组(H)具有显著的效果可以降低这三种炎性因子的产生(p0.05)。(5)通过SOD、GSH-PX检测,发现高剂量的芩白清肺合剂(H)能够显著的提高肺中的抗氧化酶,减轻肺组织损伤(p0.05)。(6)根据镜下HE染色与肺组织损伤评分,发现芩白清肺合剂高剂量组(H)具有良好的抑制疾病发生进展的效果。结论;确定了芩白清肺合剂的制备工艺和方式,并使其工艺合理,成本低廉易于操作。制定了芩白清肺合剂的质量评价标准与高效液相的测定方法。采用了网络药理学这一种全新的数据挖掘方式,进行治疗靶点的预测,并在后期进行实验验证。发现芩白清肺合剂,能通过影响NF-κB和TNF这两个信号通路,影响ALI(急性肺损伤)疾病的发生发展。最后利用药效学的手段,进行中药合剂的效果评价,发现芩白清肺合剂可以通过影响氧化应激和炎症反应来降低LPS(脂多糖)诱导的ALI(急性肺损伤)。


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