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调节Nrf2/ARE/HO-1通路抑制Aβ神经毒性损伤的机制研究

王洪权  
【摘要】:大量研究表明,氧化应激是神经退行性疾病阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的一个显著的病理特征。神经退变在除了有系统的氧化应激的表现外,在生物化学和神经病理水平,这些疾病的神经退变与脂质、核酸和蛋白的氧化损伤的标志物共存。鉴于氧化应激的病理影响,针对抗氧化损伤的治疗方法成为了治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的靶标。 氧化应激(Oxidative stress, OS)与AD的发病密切相关。AD的病理特征之一为由beta-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)沉积形成的老年斑。AD发病机制的“Aβ学说”认为Aβ在特定脑区的聚集,介导氧化OS损伤,OS在AD的发生和进展中发挥主要的作用,AD患者脑中存在广泛的OS。Aβ可以在体内和体外诱导OS。最近研究显示,氧化应激促进Aβ的产生和聚集,反过来Aβ又诱导氧化应激,OS从而进一步增加Aβ的产生,如此在OS和Aβ之间形成恶性循环,促进AD的发生。因此,一项具有广泛前景的预防和治疗AD的方法为减弱或抑制Aβ诱导的氧化应激损伤。同时一些天然抗氧化剂,如石杉碱甲(Huperzine A),姜黄(Curcumin),银杏(Ginkgo biloba),和人参皂甙Rg1(Ginsenoside Rg1)已经证实可以抑制Aβ诱导的氧化应激损伤。 虾青素(Astaxanthin, ATX)其主要存在于特定的海洋动物和植物,如鱼、虾和海藻内。ATX是强效抗氧化剂。ATX具有许多重要的生物功能。最重要的是ATX的抗氧化活性。ATX被认为是治疗如AD和帕金森病(Parkinson's diseasePD)的神经系统疾病的最佳候选药物。的确,有报道显示,ATX可以在体外抑制6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的神经元凋亡的发生。ATX可以通过抑制氧化应激、减少谷氨酸的释放和抗凋亡来减少脑组织因缺血引起的相关损伤。麦角甾苷(Acteoside, AS)是一种糖苷类化合物,其最早分离自毛蕊花素(Verbascum sinuatum)并被命名为"verbascoside"。1968年,Birkofer阐明了其化学结构,并引进了其新的名字"Acteoside"。以前研究表明,麦角甾苷具有许多药理学活性,如抗炎、肝保护活性、抗凋亡活性和抗氧化活性。最近研究显示,麦角甾苷具有神经保护活性,其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)(?)氨酸诱导的神经损伤。然而,虾青素和麦角甾苷神经保护作用机制以及它们是否抑制Aβ诱导的神经毒性尚不明了,本课题拟研究这两种药物的抗AD的作用及其相应机制。 许多研究表明,血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)具有对抗氧化损伤诱导的神经元损伤的保护作用,在PD中已HO-1已明确为保护性因子。就AD而言,研究显示HO-1 mRNA水平在AD新皮质和脑血管升高,并且HO-1高分布于tau蛋白形成的神经元纤维缠结和Aβ沉积形成的老年斑这两种AD特征性病理结构。APP过表达的AD转基因鼠中也见类似的现象。重要的是2000年Snyder研究组发现HO-1表达增加并不促进Aβ生成,而APP尤其是AD病理突变的APP可抑制HO-1的生物活性进而使神经元易受毒性物质的损害。因此,我们认为HO-1参与抑制Aβ诱导损伤的机制,在神经元内表达对AD起保护作用,HO-1的表达上调参与一些天然化合物的药理学机制。通过HO-1表达的诱导剂(Inducer)上调HO-1的表达来增强细胞的抗氧化能力,可能成为预防和治疗AD的措施。 因此,本研究探讨素虾青素(Astaxanthin, ATX)和麦角甾苷(Acteoside, AS)是否抑制Aβ_(25-35)诱导的神经毒性损伤,以及HO-1在这一过程中的作用,虾青素和麦角甾苷是否通过上调HO-1的表达进而抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤,并探讨了相应的机制。 主要研究内容如下: (一)虾青素通过ERK1/2通路上调HO-1表达并抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1.虾青素抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1)ATX抑制Aβ25-35诱导的细胞损伤,ATX剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞活力的降低。 2)ATX阻止Aβ25-35诱导的细胞凋亡的发生,Hoechst染色发现,ATX减少Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞凋亡比例以及ATX剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的caspase-3的激活。 3)ATX抑制Aβ25-35诱导的氧化应激损伤, H2DCF-DA荧光染色检测细胞内ROS,结果表明ATX抑制Aβ25-35诱导的细胞内ROS的产生 4)罗丹明123荧光染色检测线粒体膜电位,结果显示ATX抑制Aβ25-35诱导的线粒体膜电位的降低。 5) Western Blot免疫印迹显示,Aβ25-35引起Bcl-2/Bax下调,而ATX上调Bcl-2/Bax的水平比例。 6)Aβ25-35诱导JNK和p38MAPK的激活,ATX剂量依赖性抑制Aβ25-35诱导的JNK和p38MAPK的激活。 2.虾青素上调HO-1的表达参与抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1)ATX在体外剂量依赖性和时间依赖性诱导HO-1的表达。 2)Aβ25-35剂量依赖性诱导HO-1的表达,同时ATX易化Aβ25-35诱导HO-1的表达上调。 3)HO-1活性抑制剂ZnPP预处理后,发现ZnPP逆转虾青素抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤的保护作用,说明虾青素上调HO-1的表达参与抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。 4)ATX时间依赖性和剂量依赖性激活ERK1/2, ERK1/2抑制剂PD98059抑制ATX诱导的HO-1表达上调,结果提示ERK1/2参与ATX诱导HO-1表达上调。 5)ERK1/2抑制剂PD98059逆转ATX抑制Aβ25-35神经毒性损伤的保护作用。 (二)麦角甾苷通过ERK1/2和PI3K/Akt通路上调Nrf2依赖的HO-1表达上调抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1.麦角甾苷抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1)麦角甾苷抑制Aβ25-35诱导的细胞损伤,MTT分析和calcein染色发现,麦角甾苷剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞活力的降低。 2) Hoechst染色以及DNA Ladder分析发现,麦角甾苷抑制Aβ25-35诱导的凋亡的发生。 3) H2DCF-DA荧光染色发现麦角甾苷抑制Aβ25-35诱导的细胞内ROS的产生,表明麦角甾苷抑制Aβ25-35诱导的氧化应激损伤。 4)罗丹明123荧光染色发现,Aβ25-35诱导线粒体膜电位的降低,而麦角甾苷剂量依赖性抑制Aβ25-35诱导的线粒体膜电位的降低。 5)麦角甾苷影响凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平的改变,Western Blot免疫印迹显示,Aβ25-35引起Bax/Bcl-2上调,而麦角甾苷剂量依赖性抑制Bax/Bcl-2比例上调。 6) Western Blot免疫印迹显示,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞线粒体细胞色素c的释放,而麦角甾苷剂量依赖性抑制Aβ25-35诱导的线粒体细胞色素c的释放。 7) Western Blot免疫印迹显示Aβ25-35引起的Caspase-3的激活,麦角甾苷剂量依赖性抑制Aβ25-35引起的Caspase-3的激活。 2.麦角甾苷上调HO-1的表达抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤 1) Western Blot免疫印迹结果显示,麦角甾苷在体外时间依赖性和剂量依赖性诱导诱导HO-1的表达,免疫荧光结果显示上调的HO-1主要分布于细胞浆内;Western Blot免疫印迹结果显示,麦角甾苷在体内时间依赖性诱导HO-1的表达;免疫组化结果表明,HO-1主要表达于神经元。 2)麦角甾苷激活Nrf2, Western Blot免疫印迹结果显示,麦角甾苷时间依赖性上调Nrf2和磷酸化Nrf2的表达;Western Blot免疫印迹结果显示,麦角甾苷时间依赖性和剂量依赖性促进Nrf2的进入细胞核,免疫荧光结果亦显示麦角甾苷促进Nrf2的进入细胞核。 3) Nrf2 siRNA可以抑制麦角甾苷引起的HO-1的表达上调,结果提示,麦角甾苷引起的HO-1的表达上调需要Nrf2的激活,Nrf2的激活参与麦角甾苷诱导的HO-1的表达上调。 4)麦角甾苷通过ERK1/2和PI3K/Akt激活Nrf2。Western Blot免疫印迹结果显示,麦角甾苷时间依赖性激活ERK1/2和PI3K/Akt, ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制麦角甾苷引起的Nrf2表达上调,以及免疫荧光结果显示PD98059和LY294002抑制麦角甾苷引起的Nrf2进入细胞核,这些结果提示ERK1/2和PI3K/Akt参与Nrf2的激活。 5)麦角甾苷通过ERK1/2和PI3K/Akt上调HO-1的表达。Western Blot免疫印迹结果显示,ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002剂量依赖性抑制麦角甾苷引起的HO-1表达上调,结果提示,ERK1/2和PI3K/Akt参与麦角甾苷诱导的HO-1的表达上调。 6)麦角甾苷通过上调HO-1的表达抑制Aβ诱导的神经毒性损伤。HO-1活性抑制剂ZnPP预处理后,发现ZnPP逆转麦角甾苷对Aβ25-35诱导的神经毒性损伤的抑制作用,说明麦角甾苷上调HO-1的表达参与抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。 7) ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002逆转麦角甾苷对Aβ25-35诱导的神经毒性损伤的抑制作用。 总之,我们的研究证明了,通过天然化合物诱导剂诱导上调HO-1的表达可以抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤,为HO-1上调表达参与对抗Aβ25-35引起的神经毒性损伤作用提供了直接的证据。我们鉴定出了两个促进HO-1表达的诱导剂,即虾青素和麦角甾苷。虾青素通过ERK1/通路上调HO-1表达并抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤,而麦角甾苷通过ERK1/2和PI3K/Akt通路上调Nrf2依赖的HO-1表达上调抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。我们的研究首次表明通过天然化合物来上调HO-1表达可以抑制Aβ25-35诱导的神经毒性损伤。为探讨HO-1作为AD的治疗靶标,为虾青素和麦角甾苷作为AD的潜在预防和治疗药物提供了科学的实验基础。


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