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热休克因子1参与粒细胞集落刺激因子对心脏缺血再灌注保护作用的机制研究

马宏  
【摘要】:血供再通治疗是目前缺血性心脏病的主要治疗手段。在血供再通治疗中缺血再灌注损伤是普遍存在的病理变化。它涉及氧化应激、炎症反应等环节,严重影响了血供再通治疗的效果。如何在冠脉血运重建治疗中保护心脏,避免缺血再灌注损伤已经成为心血管研究领域的热点之一。 目前这个领域中一个主要的研究方向是利用预处理的方法唤起心脏内在的保护信号通路。预处理的主要方法包括缺血前处理和缺血后处理,但是它们各自的特点限制了临床上的应用。利用药物模拟预处理对心肌的保护机制是另一种积极的探索,其中粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是主要候选药物之一。然而,G-CSF 1临床试验结果的不一致提示复杂的临床背景可能影响了G-CSF对心脏的保护效果,因此对G-CSF在病理环境下的作用机制进行更加深入的研究尤其重要。 热休克因子1(Heat Shock Factor 1, HSF1)及其调节的热休克反应是机体对抗各种损伤的重要内在保护机制。HSF1可以激活多种热休克蛋白,它们具有多种功能,可以充当分子伴侣,帮助蛋白折叠、转运,在生长、发育、炎症等多种病理生理过程中都发挥了重要作用。 已有研究发现HSF1在心脏缺血再灌注损伤中可以发挥抗凋亡、抗炎症、增加心肌舒缩能力等多种作用。同时,在各种不同的病理状态下,或是各种临床药物的干预下,HSF1的表达水平和活性状态都会发生变化。 目前G-CSF对心脏的预处理保护机制主要集中在活化内源性的保护激酶。作为一种重要的内源保护性因子,HSF1是否参与了G-CSF对心脏的保护作用,还有待进一步阐明。这在很大程度上有助于揭示G-CSF在临床应用中效果不一致的原因,并更深入的理解G-CSF对心脏保护作用的机制。 第一部分心脏缺血再灌注损伤中HSF1是G-CSF保护作用重要的信号分子 假设:粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够通过激活心脏内的保护激酶在缺血再灌注损伤中保护心脏。热休克因子1 (HSF1)是心脏缺血再灌注损伤中重要的内在保护因子,有可能也参与了G-CSF对心脏的保护作用。 目的:本部分实验是为了研究HSF1是否参与了G-CSF对心脏缺血再灌注损伤的保护机制。 方法:(1)以同窝的野生型小鼠做对照,在HSF1基因敲除小鼠上连续3天皮下给予G-CSF (100μg/kg/day),然后通过结扎冠状动脉前降支,缺血30分钟后再灌注24小时。通过超声、血流动力学和组织染色的方法,评价心功能和心脏梗死范围。(2)在原代培养心肌细胞给予G-CSF,并将HSF1的siRNA转染心肌细胞,经由过氧化氢刺激24小时,通过AnnexinⅤ染色,观察G-CSF减少心肌细胞凋亡的情况,并比较HSF1siRNA干扰后是否影响G-CSF对心肌细胞的保护作用。 结果:(1)在野生型小鼠中,给予G-CSF能够明显改善心功能,降低梗死面积;而在HSF1敲除小鼠中,G-CSF对心脏的保护作用消失。(2)在未进行HSF1 RNA干扰的心肌细胞中,给予G-CSF能够显著减少过氧化氢诱导的凋亡;而当HSF1表达水平下降后(RNA干扰组),G-CSF不能减少心肌细胞的凋亡 结论:HSF1参与了G-CSF对缺血再灌注损伤中心脏的保护作用并发挥了重要作用。 第二部分HSF1/STAT3是G-CSF对缺血再灌注损伤心脏保护作用的重要信号通路 假设:粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够通过Jak2/STAT3信号通路减少缺血再灌注对心脏的损害。热休克因子1 (HSF1)是心脏的内在保护因子之一,有可能与STAT家族相互作用。 目的:研究心脏缺血再灌注损伤中,G-CSF的保护作用是否与HSF1和STAT3的相互作用相关。 方法:(1)在心脏体外灌流模型和培养的心肌细胞中检测HSF1表达水平和活性与施加G-CSF的关系。(2)在乳鼠心肌细胞中观察G-CSF对STAT3磷酸化的作用。(3)在抑制STAT3活性的情况下,观察G-CSF对HSF1的作用是否发生变化。(4)分别在降低HSF1表达水平和抑制HSF1活性的情况下,观察G-CSF对STAT3的活化是否改变。(5)通过免疫共沉淀技术,观察HSF1和STAT3的相互作用。 结果:(1)在体外灌流心脏中,缺血再灌注损伤和G-CSF处理并不改变HSF1的转录水平;利用G-CSF处理乳鼠心肌细胞,HSF1 mRNA水平并不随时间变化而变化,但是可以增加HSF1的磷酸化(Ser230)水平,进而促进热休克蛋白(HSP)的生成。(2)G-CSF可以活化心肌细胞中的STAT3,并呈现时间依赖性。(3)用S3I-201抑制STAT3的活性后,G-CSF对HSF1的活化明显被削弱。(4)分别采用RNA干扰HSF1和用KNK437抑制HSF1的方法,观察到G-CSF对STAT3的激活明显减弱。(5)进一步的免疫共沉淀实验发现,HSF1和STAT3存在相互作用,G-CSF处理后两者结合增加,这种变化可以被各自的抑制剂所抑制。 结论:G-CSF在缺血再灌注损伤中并不改变HSF1的表达水平,而是通过提高HSF1活性的方式增强心肌细胞的内在保护机制;HSF1和STAT3可能通过直接结合,在G-CSF作用下以共激活因子的形式发挥保护作用。 重要性和创新点 1)揭示了在心脏缺血再灌注损伤中,G-CSF药物预处理的保护机制与热休克因子1 (HSF1)及其调控的热休克反应相关。HSF1的表达水平和活性状态直接关系到G-CSF对心脏保护作用的效果。 2)将心肌细胞内在的HSF1保护机制和预处理中保护激酶(RISK)信号通路中的STAT3联系在一起,对预处理保护机制的分子网络起到一定完善作用。 3)明确了HSF1与STAT3是G-CSF预处理保护机制中一对重要的调节因子,并且不同于以往的观点,STAT3不但是缺血晚期反应的重要的信号分子,还可能通过HSF1在再灌注早期也发挥保护作用。 4)针对G-CSF临床试验与基础研究中保护效果的不一致,根据本实验的结果,提出了一种假设,即复杂的临床背景干扰了HSF1在机体内的状况,G-CSF无法正常唤起心脏内在的保护机制,造成临床治疗效果的不一致。


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