盐酸小檗碱对高脂饮食诱导的SD大鼠非酒精性脂肪肝的疗效及机制研究

【摘要】：目的 通过高脂饲料诱导的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease NAFLD) Sprague-Dawley (SD)大鼠动物模型,观察盐酸小檗碱对非酒精性脂肪肝的治疗效果；并筛选NAFLD异常表达的脂代谢相关基因,及其与脂代谢紊乱的关系,从表观遗传学探讨基因表达异常的机制及盐酸小檗碱的作用机制。 方法 6周龄SD大鼠,随机分为正常饮食组、高脂饮食组,给予相应饮食饲养8周,高脂饮食饲养组大鼠经肝脏病理切片确认为NAFLD模型成功后,高脂饮食组再次随机分为盐酸小檗碱(Berberine, BBR)干预组及溶剂对照组。给予相应药物连续灌胃16周,药物治疗期间每周测体重,计算进食情况,每月测空腹血糖、胰岛素、甘油三酯(triglyceride, TG)、胆固醇(Cholestorel, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholestorel, LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholestorel, HDL-c)、谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(AST),药物干预第16周末行腹腔内糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)，第二天处死,收集血及组织标本,肝组织行冰冻切片苏丹Ⅲ脂肪染色及肝脏匀浆测TG含量。提取三组肝脏RNA,采用real-time PCR对脂代谢关键基因进行定量检测mRNA水平。肝脏组织提取DNA,进行亚硫酸盐处理,采用PCR产物测序及亚克隆/测序方法对real-time PCR定量检测出正常饮食对照组与高脂饮食对照组表达差异的基因启动子区域进行DNA甲基化程度。采用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography, FPLC)分析了血清脂蛋白成分的变化。 结果 高脂饮食饲养8周能诱导SD大鼠肝脏脂质沉积,成功建立NAFLD模型。BBR干预16周能明显减轻NAFLD大鼠体重、内脏脂肪总量及肝脏的湿重,改善脂代谢紊乱,从病理组织学及提取肝脏TG含量的结果表明BBR能改善高脂饮食诱导的脂肪肝,并且改善胰岛素敏感性。高脂饮食对照组大鼠肝脏存在脂代谢相关基因如微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)肉碱棕榈酰转移酶(CPTlα)及硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)的表达异常,且BBR能够纠正这些基因的表达异常及增加血清VLDL-TG水平。对这些基因的表达改变的机制进行研究,结果表明高脂饮食饲养大鼠肝脏MTTP启动子区域平均甲基化水平和5个CpG位点中的3个(-174,-113及-20)甲基化程度显著高于正常饮食对照组。并且BBR显著减低这些CpG位点的甲基化程度(最多至30%)。相关性分析结果表明-113和-20CpG位点的甲基化程度与MTTP mRNA水平呈显著负相关。这些研究结果提示高脂饮食导致肝脏MTTP基因启动子区域高度甲基化,影响MTTP的转录,从而引起MTTP mRNA水平的下降。另外,选定调控LDLR和CPT-lα转录的关键启动子区域序列CpG位点没有观察甲基化的修饰,推测LDLR和CPT-lα的表达调控可能受到其他机制的影响如组蛋白修饰等。 结论 本研究发现盐酸小檗碱能够改善高脂饮食诱导SD大鼠脂肪肝及改善胰岛素敏感性。进一步研究表明,盐酸小檗碱能够逆转高脂饮食诱导NAFLD大鼠肝脏脂代谢关键基因MTTP、LDLR、CPT-lα及SCD-1的表达异常有关,而且能够降低MTTP启动子区域甲基化程度、调节MTTP基因的表达,增强了肝脏以VLDL形式向外转运TG。因此BBR通过纠正这这些基因的表达异常、增强了肝脏脂肪酸氧化、抑制脂质合成、促进VLDL合成及分泌,从而改善脂肪肝。