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PI3K/Akt信号通路调控孕激素对子宫内膜癌的作用及分子机制研究

顾超  
【摘要】:子宫内膜癌的发病率正逐年增高,其中75%-85%的Ⅰ型子宫内膜癌为内膜样腺癌,孕激素大量、长期应用为子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌保守治疗的主要方法。但大剂量孕激素保守治疗有效率均只有70%左右,对于这类孕激素治疗失败的患者,即使年轻尚有生育要求的子宫内膜不典型增生过长妇女,也不得不切除子宫,严重影响生活质量并增加医疗支出。如何提高Ⅰ型子宫内膜癌孕激素治疗敏感性,保留患者的生育功能一直是课题组关注的焦点所在。同时能量代谢异常者子宫内膜癌高发生率,高耐药率的现象提示,细胞能量代谢失衡与子宫内膜癌PR耐药机制可能相关。 孕激素作用的经典通路为与孕激素受体(progesterone receptor, PR)结合后,以二聚体形式与孕激素反应元件(progesterone response element, PRE)相结合,通过募集共激活子、普通转录因子和共抑制子与PRE启动子相结合而启动转录,激活靶细胞内调节基因表达而产生生物学效应,但孕激素对内膜癌细胞具有促进或抑制增生双向作用的现象并不能用孕激素受体经典通路来解释。近些年的研究提示激素受体普遍存在非转录信号传导途径,这些“非基因”途径不依赖基因转录或蛋白合成,而是与激素诱导调节细胞质或细胞膜结合调节蛋白相关。在孕激素核受体缺失的内膜癌细胞,孕激素可能通过不由孕激素核受体介导转录的非经典途径,促进内膜癌细胞的增生。 有研究提示乳腺癌中胰岛素样生长因子受体(IGF-1 R)和ER的串话调节诱导快速非经典通路ER信号途径激活,导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K)-serine/threonine protein kinase B (PKB or Akt)活化,促使乳腺癌细胞增殖,这提示在调控细胞增生、周期、凋亡、转移等许多过程中起重要作用的P13K/Akt通路参与激素受体非经典通路。有关孕激素可激活PI3K/Akt通路,阻断孕激素核受体不能完全消除孕激素对PI3K/Akt通路激活作用的现象提示,孕激素可不经孕激素核受体介导,直接激活PI3K/Akt通路。探讨PI3K/Akt是否参与调控孕激素对子宫内膜癌作用及其中的作用机制对于进一步明确子宫内膜癌孕激素治疗不敏感的机制,提高临床保守治疗成功率具有重大的指导意义。 本研究利用分化好、雌孕激素受体阳性、对孕激素反应良好的子宫内膜癌细胞系、分化低、雌孕激素受体阴性、对孕激素反应低下的子宫内膜癌细胞系及以MPA为诱导剂,采用持续作用、梯度递增的方法诱导获得的孕激素耐药的内膜癌lshikawa细胞亚系,探讨PI3K/Akt参与调控子宫内膜癌孕激素耐药的可能机制及与能量代谢相关基因的关系。 本课题共分三部分:Ⅰ、孕激素对孕激素敏感或耐药人子宫内膜癌细胞的PI3K/Akt信号通路的不同影响;Ⅱ、通过抑制PI3K/Akt信号通路来逆转子宫内膜癌孕激素耐药的机制;Ⅲ、利用反向蛋白芯片研究子宫内膜癌孕激素耐药株基因表达以及二甲双胍逆转孕激素耐药的初步研究 第一部分 孕激素对孕激素敏感或耐药人子宫内膜癌细胞PI3K/Akt的不同影响 目的检测孕激素对不同PR表达子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路活性的影响,及与孕激素耐药发生的关系。 方法利用子宫内膜癌Ishikawa细胞,HEC-1A细胞以及MPA为诱导剂,采用浓度递增(1—10μM)、持续给药的方法由Ishikawa诱导建立的子宫内膜癌孕激素耐药细胞(progestin-R Ishikawa),以SRB法检测孕激素对不同细胞内膜癌细胞株增殖的影响;RT-PCR技术及Western blot检测子宫内膜癌细胞内PR的mRNA水平和蛋白水平表达;Western blot技术检测MPA对不同子宫内膜癌细胞株PI3K/Akt通路活性影响;利用SiRNA技术基因沉默或质粒过表达PR基因后检测孕激素对不同内膜癌细胞株PI3K/Akt信号通路活性影响及治疗效果比较。 结果(1)不同PR表达的子宫内膜癌细胞孕激素治疗敏感性不同:1、10、20μM的MPA对于Ishikawa细胞抑制率分别为17.8%,22,3%及32.9%,具有剂量抑制效应,但对于HEC-1A细胞和Progestin-R Ishkawa细胞没有明显抑制作用。(2)孕激素对于孕激素敏感与耐药子宫内膜癌细胞的PI3K/Akt通路活性影响不同:孕激素治疗可激活progestin-R Ishikawa及HEC-1A子宫内膜癌细胞磷酸化Akt (pAkt)表达,但抑制Ishkawa细胞pAkt表达。(3)子宫内膜癌孕激素对PI3K/Akt通路活性的影响与PR表达水平相关:Progestin-R Ishkawa质粒转染过表达PR后,孕激素可抑制细胞PI3K/Akt通路;Ishkawa细胞SiRNA沉默PR基因后,孕激素可快速激活细胞PI3K/Akt通路。 结论长期孕激素治疗会导致孕激素敏感子宫内膜癌PR表达下调,从而导致孕激素耐药。在PR阴性或低表达子宫内膜癌细胞中,孕激素可不通过孕激素受体经典通路而直接激活PI3K/Akt信号通路,促进细胞增生。 第二部分 抑制PI3K/Akt通路可上调PR表达,逆转子宫内膜癌孕激素耐药 目的探讨抑制PI3K/Akt通路与逆转子宫内膜癌孕激素耐药的关系。 方法以PI3K特异性抑制剂LY294002预处理子宫内膜癌细胞,采用Western blot方法检测LY294002作用0、24、48、72、96小时后细胞PR的蛋白表达;MPA及LY294002单用或联合作用于不同子宫内膜癌细胞株,采用SRB法检测细胞增殖;应用子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型检测MPA及LY294002单用或合用对子宫内膜癌移植瘤的不同治疗效果。 结果(1)抑制孕激素耐药PI3K/Akt信号通路可促使孕激素耐药子宫内膜癌细胞PR表达增强;(2)抑制PI3K/Akt信号通路可有效抑制孕激素敏感及耐药子宫内膜癌细胞增殖,对孕激素耐药子宫内膜癌细胞的抑制增殖作用更为显著:10μM MPA及1μM LY294002,10μM MPA及5μM LY294002对Ishikawa, progestin-R Ishikawa以及HEC-1A的抑制率分别为33.7%、49.5%、48.1%和44.5%、70.8%、60.9%;(3)动物实验证实体内抑制PI3K/Akt信号通路可以逆转子宫内膜癌孕激素耐药,且孕激素和PI3K抑制剂联用可更有效抑制子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤的增殖:MPA及LY294002联合用药组的裸鼠皮下移植瘤重量与空白对照组相比,分别减少了42.3%、61.5%和48.9%(P0.05)。 结论抑制孕激素耐药子宫内膜癌细胞的PI3K/Akt信号通路,可以上调PR表达,恢复孕激素受体经典信号通路,逆转孕激素耐药。孕激素和PI3K抑制剂联用可更有效地运用于治疗孕激素耐药子宫内膜癌。 第三部分 利用反向蛋白芯片研究孕激素耐药内膜癌细胞基因表达特点及二甲双胍逆转孕激素耐药的初步研究 目的检测二甲双胍对子宫内膜癌尤其是孕激素耐药子宫内膜癌细胞增殖的影响,并检测与PI3K/Akt信号通路的关系。 方法利用反向蛋白芯片分析(reverse phase protein array, RPPA)技术比较孕激素敏感与耐药内膜癌细胞115个在增殖或凋亡中起重要作用的因子;以Western blot法检测孕激素敏感及耐药子宫内膜癌细胞中生长因子系统IGF-1R的表达;二甲双胍处理孕激素敏感及耐药子宫内膜癌细胞后,以SRB法检测孕激素对不同内膜癌细胞增殖的影响,Western法检测子宫内膜癌细胞AMPK的蛋白水平变化,RT-PCR技术及Western blot法检测子宫内膜癌细胞PR的mRNA水平和蛋白水平的表达变化。 结果(1)孕激素耐药子宫内膜癌细胞中IGF-1R相关通路过度激活;(2)二甲双胍可逆转子宫内膜癌细胞孕激素耐药;(3)二甲双胍逆转子宫内膜癌孕激素耐药的作用与抑制PI3K/Akt信号通路及上调PR表达相关。 结论二甲双胍可逆转子宫内膜癌细胞孕激素耐药,该作用可能与改变能量感受器AMPK表达,抑制PR非经典途径PI3K/Akt信号通路,恢复PR经典途径相关。 上述结果提示:子宫内膜癌细胞孕激素不经PR转录而直接激活PI3K/Akt信号通路的机制在孕激素耐药发生中起重要作用。PR表达量变化是调控孕激素对内膜癌细胞PR经典途径或非经典PI3K/Akt途径的关键。长期孕激素治疗会导致孕激素敏感子宫内膜癌PR表达下调,随着PR表达丢失,子宫内膜癌PR经典途径受抑制,非经典途径占主导,子宫内膜癌细胞由激素依赖型转为生长因子依赖型。从而导致孕激素耐药。抑制PI3K/Akt信号通路,不仅可以上调PR表达,也可以逆转子宫内膜癌孕激素耐药。二甲双胍通过降低循环工GF-1通路活性,抑制非经典途径PI3K/Akt,上调PR水平来恢复子宫内膜癌细胞对孕激素诱导的抑制增殖作用的敏感性,并激活能量感受器AMPK恢复细胞能量代谢,从而逆转子宫内膜癌孕激素耐药。 本课题提出,子宫内膜癌细胞中PR经典途径或非经典途径相互调控,利用抑制PI3K/Akt信号通路的方法可逆转子宫内膜癌孕激素耐药。子宫内膜癌中存在"AMPK-IGF-1R-PR/PI3K/Akt"的孕激素治疗网络,代谢综合征患者高发子宫内膜癌以及孕激素耐药可能与该网络失衡相关,细胞能量代谢失衡与子宫内膜癌PR信号通路可能相关。临床上可运用孕激素和PI3K抑制剂联用治疗孕激素耐药子宫内膜癌患,提高保守治疗成功率。该研究可为二甲双胍在临床上治疗子宫内膜癌的运用提供理论基础,为子宫内膜癌孕激素耐药的诊断、治疗提供了新丝路。


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