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慢病毒介导Smad7基因对角膜增殖与纤维化的抑制作用

王惕  
【摘要】:[背景及目的] 准分子激光表层角膜切削术(surface ablation)包括准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)、准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(laser subepithelial keratomileusis, LASEK),微型角膜刀法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(epipolis laser in situ keratomileusis, Epi-LASIK),较准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis, LASIK)而言,更为安全,并且减少了术后像差。所以,表层角膜切削术受到越来越多的关注。但是,表层角膜切削术也有其目前无法避免的不足,即术后角膜出现上皮下基质表层的混浊,排列紊乱的胶原沉积,临床上称为角膜上皮下混浊(haze)。Haze是表层角膜切削术最常见的术后并发症,角膜透明度下降,可引起视力或视觉质量下降、屈光回退。既往研究表明haze的产生与角膜创面的愈合过程和角膜细胞的反应直接相关。角膜创面的愈合过程是由多种细胞因子、生长因子和趋化因子介导的级联反应。该级联反应刺激角膜基质细胞发生凋亡,继而诱发周围基质细胞移行、活化、增殖,并向肌成纤维母细胞转化,同时分泌大量细胞外基质,大量排列紊乱的胶原物质,以Ⅲ型胶原纤维为主,无规律沉积于角膜上皮下,即形成haze。所以抑制角膜基质细胞的移行、活化、增殖和转化,减少胶原物质的产生是控制haze的关键。而在haze形成过程中的角膜基质细胞的增殖与纤维化与TGFβ的关系最为密切,阻断TGFβ的作用是减少角膜增殖与纤维化,抑制haze的关键。在TGFβ信号传导过程中,Smad7作为TGFβ受体后下游的抑制型信号传导因子,起着至关重要的作用。Smad7可以通过自分泌负反馈环来控制TGFβ信号的强度和持续时间。 为了探讨Smad7基因治疗是否能减少角膜愈合过程中基质细胞的增殖与纤维化,本研究选择Smad7作为外源性目的基因,选用转染效率高、免疫原性低、较为安全的第三代慢病毒作为载体,构建Smad7慢病毒载体,将Smad7基因导入体外培养的大鼠角膜基质细胞和PRK动物模型角膜组织内,通过检测TGFβ的激动型信号传导因子的活化程度,角膜细胞的活化增殖和转化指标,胶原的合成情况,研究Smad7基因对角膜增殖和纤维化的作用,为基因治疗角膜haze,乃至其它角膜瘢痕,探索新的途径。 [方法] 一、大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建与鉴定 根据大鼠Smad7基因全序列,设计特异性引物,以大鼠大脑皮层和肾脏总RNA为模板,通过逆转录PCR扩增获得大鼠Smad7 cDNA片段,克隆入pcDNA-copGFP Lentivector质粒进行测序。将Smad7重组质粒转导入293细胞中,观察GFP的绿色荧光,并用real-time PCR和western blot方法检测Smad7在真核细胞中的表达。鉴定后包装成smad7'慢病毒重组载体Lv-Smad7。同法构建无Smad7外源基因的空质粒慢病毒载体Lv-plasmid作为对照病毒。 二、体外Smad7慢病毒对角膜基质细胞增殖与纤维化的抑制作用 培养大鼠角膜基质细胞,感染Lv-Smad7后检测Smad7的表达,建立Smad7阳性细胞克隆。同样方法建立空质粒阳性细胞克隆。进行分组:①正常细胞组:正常基质细胞,不加TGFβ2;②TGFβ2对照组:正常基质细胞加TGFβ2共孵育;③空质粒组:感染Lv-plasmid的阳性细胞,加ITGFβ2共孵育;④mad7组:感染Lv-Smad7的阳性细胞,加TGFβ2共孵育。TGFβ2的终浓度为10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Western blot法检测磷酸化Smad2蛋白(phosphorylated Smad2, p-Smad2)。TGFβ2刺激48h后Western blot和real-time PCR法检测α-SMA (α-smooth muscle actin)、Ki67 mRNA和蛋白的表达,Ⅲ型胶原蛋白(TypeⅢcollagen, ColⅢ) mRNA的表达。MTT法检测基质细胞生长活性。 三、体内Smad7慢病毒对角膜增殖与纤维化的抑制作用 SD大鼠96眼(右眼)随机分为4组:①假手术组:刮除角膜上皮,不予以激光切削;②手术组:行PRK手术,即刮除角膜上皮,并予以激光切削;③空质粒组:行PRK手术,并予LV-plasmid滴眼;④mad7组:行PRK手术,并予LV-Smad7滴眼。病毒液滴眼时间为手术当天及术后1w内每日1次,以后每周1次。于术后1d、1w、lm、3m采集角膜标本。real-time PCR检测角膜组织中Smad7、TGFβ2.α-SMA. Ki67, colⅢmRNA的表达,Western blot法检测角膜组织中Smad7和p-Smad2的表达。 [结果] 一、大鼠Smad7基因慢病毒载体构建成功 通过PCR扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,与载体连接成Smad7重组质粒。测序结果与GenBank序列一致。Smad7重组质粒和空质粒分别进行慢病毒包装后获得Lv-Smad7和Lv-plasmid,病毒滴度约为1.0X104ifu/μl. 二、体外Smad7慢病毒对角膜基质细胞增殖与纤维化的抑制作用 (一) Smad7基因在角膜基质细胞内的表达测定 Lv-Smad7体外感染角膜基质细胞后,检测结果表明Smad7在转录和翻译水平上的表达均明显增强,证实Lv-Smad7成功感染基质细胞,并能在细胞内高效表达。 (二) p-smad2蛋白的Western blot检测结果 Smad7组p-Smad2蛋白量较空质粒组下降,而TGFβ2对照组较正常细胞组增加。 (三) ColⅢα1链mRNA的real-time PCR检测结果 结果显示,TGFβ2可以促使正常角膜基质细胞合成colⅢ增加,TGFβ2对照组与正常细胞组比较P0.05;而导入Smad7后,colⅢα1链mRNA的表达受到抑制,Smad7组为空质粒组的38.3%,Smad7组与空质粒组比较P0.05。 (四)α-SMA和Ki67 mRNA和蛋白表达的检测结果 TGFβ2可使角膜基质细胞内α-SMA和Ki67的mRNA和蛋白的合成均增多(P均0.05),而导入Smad7后,α-SMA和Ki67的合成均受到抑制,Smad7组与空质粒组比较,差异有显著性意义(P均0.05) (五)MTT法检测细胞生长活性结果 TGFβ2促进角膜基质细胞增殖;而Smad7可阻断这种作用,使细胞生长活性减弱,Smad7组与空质粒组比较,差异有显著性意义(P均0.05) 三、体内Smad7慢病毒对角膜增殖与纤维化的抑制作用 (一) Smad7 mRNA和蛋白在角膜组织中的表达 real-time PCR和Western Blot结果显示各时间点Smad7 mRNA及蛋白表达量Smad7组较空质粒组增高(P均0.05),1m达高峰,3m时仍持续高表达。 (二)角膜组织中p-Smad2蛋白的Western blot检测结果 术后1d起手术组p-Smad2的表达即开始增高,并持续至3m,与假手术组比较差异有显著意义(P均0.05)。而Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时pSmad2蛋白的表达量均下降,差异存在显著性意义(P均0.05) (三) TGFβ2,α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的检测结果 ①术后1w、1m、3m时TGFβ2 mRNA的表达于术组较假手术组增高,差异存在显著性意义(P均0.05);而Smad7可减少TGFβ2合成,同时间点Smad7组较空载质粒组TGFβ2明显减少(P均0.05) ②术后1w起α-SMA mRNA的表达开始增高,1m为高峰,持续至3m仍有较高表达(P手术组vs假手术组均0.05);而Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时α-SMA mRNA的表达均下降,分别为空质粒组的82.7%、67.6%和59.5%(P均0.05)。 ③术后1d起手术组Ki67 mRNA的表达即增高(P组2vs组10.05),1w及1m为高峰,3m时Ki67的表达量较1m时下降(P3mvs1m0.05)。Smad7组1w、1m、3m时Ki67mRNA的表达均较空载质粒组减少(P均0.05) ④colⅢmRNA的表达术后1w起手术组开始增高,1m为高峰,持续至3m仍有较高表达,与假手术组比较差异有显著意义(P均0.05)。而同时间点Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时colⅢmRNA的表达量均下降(P均0.05)。 [结论] 一、Smad7慢病毒重组载体构建可行,在大鼠角膜体内外可高效表达。 二、体外研究表明Smad7基因导入大鼠角膜基质细胞可阻断TGFβ信号传导通路,减少smad2的磷酸化,阻止基质细胞的活化增殖,阻断基质细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白Ⅲ的合成,从而抑制角膜基质细胞增殖和纤维化。 三、体内研究表明Smad7基因治疗可降低大鼠角膜内TGFβ2 mRNA的表达,减少smad2的磷酸化,阻止角膜细胞的活化增殖,阻断角膜细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白Ⅲ的合成,抑制角膜的增殖和纤维化。 四、Smad7基因治疗可望在表层角膜切削术后减少haze的形成方面发挥作用,在减轻其它角膜病变的瘢痕形成中也可能具有作用,值得进一步研究。


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