HuD调节cpg15表达及其机制的研究

【摘要】：HuD调节cpg15表达及其机制的研究 神经可塑性相关基因cpg15在促进神经细胞的突起生长和突触的发育成熟,调节突触回路的形成,神经细胞再生和可塑性等方面发挥重要作用。许多生理、病理刺激如光刺激、神经损伤或缺血缺氧都会诱导cpgl5表达。为研究cpgl5诱导表达的机制,我们首先对cpg15 mRNA序列进行分析,发现其3’非翻译区(3'UTR)存在AU富集的序列(AU-rich elements, AREs),后者是RNA结合蛋白(RNAbinding proteins, RBPs)发挥转录后调节的主要靶点。HuD蛋白是一种神经元特异性的RBPs,在前体mRNA选择性剪接、RNA转运、稳定性和翻译等多个转录后环节调控靶基因的表达,从而在神经元的发育和维持过程中发挥重要作用。 我们的前期研究发现小鼠短暂性全脑缺血再灌注后,海马组织中的cpg15mRNA和蛋白表达呈阶段性上升趋势,持续14天后下降,21天恢复正常水平。同时,HuD蛋白的表达也出现与cpg15同样模式的改变,提示HuD蛋白可能和cpgl5表达存在一定的联系。 针对HuD是否参与调节cpg15表达这一问题,我们在细胞培养体系中分析了HuD过量表达对cpg15表达的影响。结果发现在HuD过量表达的细胞中,cpg15mRNA和蛋白都出现表达上调,说明HuD和cpgl5的同步表达改变之间存在着调控与被调控的关系。但是,在HuD抑制表达的细胞中,cpgl5表达没有出现明显的改变,可能因为抑制HuD的效果被Hu蛋白家族其他成员代偿所致。 为了研究cpg15基因上的核苷酸序列ARE在HuD调节cpgl5表达中的作用,我们分析了HuD对含有cpg15调节序列ARE的报告基因表达的影响。结果发现,HuD过量表达显著升高含3'UTR的报告基因的表达,而不能增加缺失ARE序列的报告基因的表达。而且,ARE序列缺失后,cpg15 mRNA和蛋白表达都不受HuD过表达的影响。这些结果说明ARE在HuD调节cpgl5表达中起重要作用。 我们接着采用免疫沉淀研究了ARE序列在介导cpg15 mRNA与HuD蛋白结合中的重要性,结果发现ARE序列介导cpg15 mRNA与HuD蛋白结合,但不是唯一序列。 我们还初步探讨了HuD的结构域对cpgl5表达的影响。不论与mRNA稳定性相关的RRM1和RRM2 (RNA-recognition motifs)的缺失、还是与poly(A)结合及翻译起始有关的Hinge region与RRM3的缺失,都减弱了HuD增加GFP-CPG15表达的能力,而且Hinge region与RRM3缺失对GFP-CPG15诱导表达的抑制作用更明显,说明mRNA稳定性和翻译调节都参与cpg15表达调控。 综合以上结果,本论文结果说明HuD通过cpg15 mRNA3'UTR区的ARE序列调节cpg15基因表达,这一过程与HuD参与cpg15 mRNA稳定性和翻译调节有关。